马 越，陈 琳，黄宗耀

(深圳市深水龙华水务有限公司，广东深圳 518000)

水库水季节性藻类激增是影响水厂水处理工艺的重要因素之一。藻类激增不仅会严重影响水质，更有堵塞砂滤池的风险。研究表明，藻类激增会使水体pH增高、总碱度降低，影响水处理效果[1]。藻细胞的死亡、腐败会产生藻源性嗅味物质，常规水处理工艺很难将其去除，进而引起出厂水的嗅味风险[2]。此外，在针杆藻激增时，倘若不能及时预警并采取相应措施，过多的针杆藻会堵塞砂滤池，严重影响生产。为使水厂能够及时有效预警该情况，对水源水中藻类种属及数量进行快速检测尤为重要。

随着技术的发展，PCR、环介导等温扩增、基因芯片、流式细胞术等技术被应用到藻类检测领域[3-8]，但是繁多的检测方法中仍缺少兼具强普适性、高准确性的适用于水厂化验室的快速检测法。目前水厂化验室对水源水中藻类的检测方法主要为叶绿素a测定法[9]和显微镜计数法。叶绿素a测定法多用于水厂在线仪表对水源水中藻类数量的监测，由于水源水浑浊度高、杂质较多、前处理不充分等，该方法存在检测结果偏差较大、不能准确反映水源水藻类含量、不能区分藻类种属的问题。显微镜计数法是目前水厂化验室藻类计数的主要方法，通过显微镜与计数框进行直接定量，前处理为沉淀法和抽滤萃取法[10]：沉淀法通常采用鲁哥试剂固定48 h，利用虹吸法去除上清液，将剩余的25 mL藻细胞沉淀液转移并定容到50 mL，利用显微镜进行物种鉴定，定性、定量分析藻类的丰度，该方法耗时较长，前处理和浓缩操作要求较高，需要有经验的化验员完成；抽滤萃取法为直接使用0.45 μm的滤膜对1 L水样进行抽滤，浓缩到50 mL后取100 μL溶液镜检，该方法耗时较短，但存在部分小且透明的藻细胞不易被观察到的问题，与国标规定的鲁哥试剂检测方法存在一定的误差，多用于应急检测。

已有研究表明，中性红易溶解在脂类物质中[11]，而微藻细胞表面的质膜含有丰富的卵磷脂和胆固醇，因此，中性红可用于微藻细胞染色。王帅等[12]发现，相较于5-氯甲基荧光素二乙酸酯、荧光素二乙酸酯，中性红更适合于检测船舶压载水中微藻活细胞。王珂等[13]以铜绿微囊藻为材料，发现中性红质量浓度为2 mg/L染色15 min时，染色率达到98%以上，而常用的台盼蓝染色效率只能达到50%左右。由此可见，中性红在铜绿微囊藻、船舶压载水微藻活细胞的检测中有较好的应用效果，但其在藻类种属较为复杂的水源水检测中应用较少。目前，实验室藻类检测方法繁多，但是没能找到一种或几种适用于水厂化验室的精确度高、快速的检测方法。在已有研究基础上结合实际应用的痛点，本研究围绕水厂化验室藻类检测沉淀法耗时长、抽滤萃取法误差较大等问题，尝试将中性红染色与抽滤萃取法相结合，利用中性红可积聚在植物细胞质或液泡内的特性，对深圳某水库中的藻细胞进行短时染色检测，结果显示中性红能够快速、高效地使水库水中常见的3种门23种属的藻细胞着色。本研究为水厂化验室提供了普适性强、操作简便、准确性高的快速藻细胞检测方法。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

本研究选择的藻种为不分种群的自然群体，取自深圳市某水库。该水库水温均值为23 ℃，浑浊度均值为2.7 NTU，总氮平均质量浓度为2.03 mg/L，总磷平均质量浓度为0.015 mg/L。原水藻细胞量为2×105～9×106个/L，主要为绿藻、硅藻和蓝藻。

1.2 染色剂的配制

中性红[13]：取1 g中性红粉末溶于100 mL蒸馏水中，30～40 ℃加热，待中性红溶解后，用滤膜过滤，配制成质量浓度为10 mg/mL的中性红储存液，装入棕色瓶中置于4 ℃保存。使用时用蒸馏水将中性红溶液稀释至所需浓度，现配现用。

鲁哥试剂[14]：将20 g碘化钾溶于200 mL 冰醋酸(10%)溶液中，溶解后再加10 g碘，全部溶解后配制成碘质量浓度为50 mg/mL的鲁哥氏碘液，贮存于密闭的棕色试剂瓶中，避光保存。

1.3 细胞染色与镜检

中性红：分别在1 L水样中加入1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 mL的中性红储存液，混合均匀，分别染色10、20、30、40 min，用0.45 μm的滤膜抽滤，随后用25 mL蒸馏水洗脱，定容至50 mL后，取100 μL在显微镜(奥林巴斯BX51)下检测，用拍摄系统(CMOS相机、万深AlgaeC浮游生物鉴定计数软件)记录染色情况，并计数拍摄染色情况。所有试验均重复3次。

鲁哥试剂：在1 L水样中加入10 mL的鲁哥氏碘液，混合均匀后自然沉降48 h，利用虹吸方法去除上清液，将剩余的25 mL藻细胞沉淀液转移并定容到50 mL，取100 μL，在同样条件下拍摄染色情况，并计数拍摄染色情况。所有试验均重复3次。

染色后采用100 μL浮游植物计数框镜检藻细胞。

染色率(r)计算如式(1)：藻细胞被中性红染成红色，每个视野里分别计算着色细胞和未着色细胞。

r=B/(A+B)×100%

(1)

其中：r——染色率；

A——视野中未着色细胞数，个；

B——视野中着色细胞数，个。

1.4 统计分析

试验数据采用相对标准偏差(RSD)分析组内检测结果的精密度，计算如式(2)。

RSD=(SD/X)×100%

(2)

其中：SD——标准偏差；

X——算数平均值。

组间分析：(1)采用中性红检测均值相对于传统鲁哥试剂检测均值的偏差来表示准确性；(2)采用组间单因素方差分析进行中性红检测均值相对于传统鲁哥试剂检测均值的差异性分析。

2 结果和讨论

2.1 中性红染藻细胞的浓度和时间

染色剂浓度对细胞染色存在较大影响，通常低浓度染色效果不好，浓度过高可能影响细胞活性。为探究中性红染色的最适质量浓度，本研究将10 mg/mL中性红储存液稀释为10.0、5.0、3.3、2.5、2.0 mg/L进行试验。结果显示，10.0 mg/L时染色过深，不适合镜检计数，2.0 mg/L染色效果较差，染色率<30%，故而排除这两种染色浓度。如图1所示，随着中性红浓度的升高，染色率逐渐增高，质量浓度增大至5.0 mg/L时染色率虽有明显提高，但是藻细胞出现明显的聚集现象，影响观察和计数；质量浓度达到3.3 mg/L时，染色率大于75%，明显优于鲁哥试剂经48 h固定的染色率。结果表明，使用3.3 mg/L中性红对水源水中藻细胞进行染色时效果最佳。

图1 鲁哥试剂和不同浓度中性红对染色效果的影响

确定针对水源水染色时中性红的最佳使用浓度后，本研究继续使用3.3、2.5 mg/L中性红对水源水中藻细胞分别染色10、20、30、40 min，重复染色3次，计算染色率。如图2所示，在10～30 min，随着染色时间的增长，染色率增加；30 min后染色率开始下降。该试验结果表明，3.3 mg/L中性红染色30 min镜检效果最佳，染色率大于80%。

图2 染色时间对染色效果的影响

2.2 基于中性红快速检测的准确性分析

中性红可将藻类检测时间缩短到30 min，相对于常规鲁哥试剂48 h检测有较大的提升，接下来，本研究连续5周使用中性红(3.3 mg/L染色30 min)和经典方法鲁哥试剂[15](固定染色48 h)检测深圳某水库藻细胞数量。结果如表1所示，中性红快速染色检测法的检测结果与常规鲁哥试剂检测方法的结果偏差在-7.74%～3.12%，小于±10%。对两种检测方法进行组间单因素方差分析，P值为0.970 6。以上结果表明中性红检测法可作为替代常规鲁哥试剂的快速染色检测法，具有较好的准确性和稳定性。

表1 基于中性红快速检测的准确性分析

2.3 中性红快速检测法在深圳某水库水藻类检测中的应用

藻类是含有光和色素的低等植物，多数个体微小，需借助显微镜检测。部分藻细胞含有大而明显的液泡，例如硅藻门中的直链藻、针杆藻、菱形藻，该类藻细胞便于镜检观察；部分藻细胞小且透明，不便于镜检观察，例如绿藻门的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻等。已有研究表明，中性红可以通过细胞摄取进入细胞并滞留在溶酶体内[16]。在活细胞中，中性红可将液泡染为红色；当细胞死亡后，中性红会充满整个细胞[17]。

鉴于此，本研究将中性红与抽滤萃取法相结合，以水源水中藻细胞为检测对象，探究了染料的最佳使用浓度和染色时间，并将该检测方法应用于深圳某水库水藻细胞的检测中。取1 L水库水于烧杯中，使用质量浓度为3.3 mg/L的中性红染色30 min，抽滤后镜检，结果如图3所示，中性红能够快速、高效地使水库水中常见的3个门的藻细胞着色。该方法不仅能将藻细胞的液泡染为红色(图3中的绿藻门小球藻属、栅藻属、盘星藻属、卵囊藻属；蓝藻门桥弯藻属、微囊藻属等)，而且能够使藻细胞的轮廓呈现出清晰的红色，便于镜检分析，较好地解决了小且透明的藻细胞的检测难题。使用该方法对深圳某水库水藻类进行连续6个月的检测，结果如表2所示，该水库水藻类主要包含5个门28个属，其中，最常见的为硅藻门、绿藻门、蓝藻门中的26个种属，该水库水大于85%的常见藻类(24个属)能够被中性红染色。综上，中性红快速检测法能够较好地解决小且透明的藻细胞的镜检难题，对于水库水中的主要藻类有较好的染色效果。

图3 中性红快速检测法的显微镜检测结果

表2 深圳某水库主要藻类和中性红染色

3 结论

(1)本文将中性红与抽滤萃取法相结合，搭建基于中性红染色的水源水藻细胞快速检测方法。中性红染色效果明显，染色最佳质量浓度为3.3 mg/L，染色时间为30 min，检测结果与常规鲁哥试剂检测结果相一致(偏差小于±10%)。该方法既能确保准确性，又能将检测时间从48 h缩短到30 min。

(2)基于中性红染色的水源水藻细胞快速检测方法能够快速、高效地使水库水中常见的3个门24个属的藻细胞着色。该方法不仅能将藻细胞的液泡染为红色，而且能使藻细胞的轮廓被标记为红色，便于镜检分析，有效地解决了小且透明的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻、菱形藻、桥弯藻、微囊藻的检测难题，为提高水厂化验室藻类检测效率和应对原水水质突变能力提供了有力的支持。