刘 稜，方逸川，孙孝龙

(西南林业大学湿地学院，国家高原湿地研究中心，云南昆明 650224)

天然有机质(NOM)是广泛存在于自然界中的一种混合物，主要由动植物残体的分解、降解等作用形成。普遍认为NOM是具有羧基、酚基、芳香基、酚羟基、脂肪链和苯环等活性官能团的混合物[1]。NOM分为腐殖质和非腐殖质两类：腐殖质分为富里酸、胡敏素和胡敏酸；而非腐殖质则包括糖类、纤维素、蛋白质等[1]。在水体和土壤中成分以腐殖质为主，占据该两种生态系统中总有机质的50%～80%[2]。腐殖质具有如酚基、氨基、羧基和硫醇基等官能团，可与金属离子、离子性、极性有机化合物发生作用，改变形态和分布情况，参与营养元素循环[3]。NOM的结构、来源和化学组成十分复杂，所以常常通过研究含有羧基、苯酚、烯醇、醇、羰基、氨和硫醇等氮氧硫官能团的芳香族和脂肪族有机化合物的异质混合物溶解性有机物(DOM)来表征NOM的性质。在环境中扮演着不可或缺角色的DOM，该物质的复杂组成成分、化学结构、不同来源和浓度差异等性质特征的变化都会对生态系统和该物质的去除效率造成影响，并对过程中可能会产生致癌副产物的多种处理工艺等方面息息相关，是毒理学、生态学、环境质量标准、污染控制与治理工程等研究十分关注的问题，因此，对有机质相关的研究是目前科研工作中的一大热点[4-5]。

三维激发-发射矩阵(EEM)是一种操作简单、消耗量小、成本低廉、分析迅速、灵敏度高的技术，但是单独使用EEM，则会出现荧光峰叠加、同类荧光峰的位置不同、无法识别等局限问题。Stedmon等[6]最早提出可有效识别EEM中信息成分并追踪它在环境中行为的平行因子分析方法(PARAFAC)，如式(1)。

(1)

其中：F——荧光因子数；

xijk——第i个样品在发射波长(Em)j和激发波长(Ex)k处的荧光强度；

εijk——模型残差；

aif——负载矩阵A中的元素；

bjf——负载矩阵B中的元素；

ckf——负载矩阵C中的元素。

aif与样品i中fth分析物的浓度(例如摩尔)成正比。bjf与fth分析物在发射波长j处的荧光量子效率(作为荧光发射的吸收能量的分数)线性相关。因此，具有典型元素bjf的矩阵是fth分析物的发射光谱的估计，直至达到标度。同样，ckf与在激发波长k下的比吸收系数(例如摩尔吸收率)线性成比例。F定义了模型中组件的数量，残差矩阵εijk代表了模型未考虑的可变性。通过最小化残差平方和的过程找到模型[6]。该模型是通过交替最小二乘算法最小化残差平方和来计算的。

多项研究表明，该方法可以去除散射峰所影响的光谱区域，如将瑞利峰以下的EEMs区域设为0，通过从样品光谱中减去Milli-Q水光谱来去除拉曼效应区域。对高残差值和杠杆值的样本采用非负性约束，将高残差值和杠杆值剔除为离群值，再进一步分析前应通过离群值函数去除[7]。通过残差分析、半剖分分析、随机初始化和目视检测各组分的光谱形状，验证最优荧光DOM组分的数量[4]。现可使用Matlab上的DOM Fluor工具箱、efc平台等可进行PARAFAC[6-7]。

三维荧光光谱-平行因子分析(EEM-PARAFAC)集成了EEM经济、高效、选择性好、灵敏度高且不破坏样品结构等诸多优点。该方法不仅解决了单独使用EEM出现的弊端，同样还拥有了PARAFAC化繁为简的特点，将大量的样本数分解成单个的荧光成分，从而确定独立荧光成分的强度和位置，还可用因子得分比值替代EEM中峰强度比值对水体进行空间区域的特征分析[8]。因此，EEM-PARAFAC拥有更系统和全面解释数据和分析数据的特有优势，易于分析DOM的结构组成等，有着非常广阔的应用前景。本文通过归纳和总结EEM-PARAFAC表征DOM的来源、结构、降解和吸附络合的相关研究，为未来该研究的进一步发展提供数据参考。

1 有机质来源

通过分析、研究和表征环境污染的源头、源强及类别，为有效全面地了解和深入研究污染的环境行为特性、生态系统的维持稳定及影响、污染的控制修复治理提供基础理论依据。

利用EEM-PARAFAC方法，发现不同土地利用类型、地区、时期、用途来源的DOM等，都会导致其中的结构和性质的不同。例如，两种不同土地类型来源的有机质差异较大，森林和湿地沉积物相比较之下，森林土壤中DOM的芳香性、疏水性分数和分子大小更高，原生源沉积物比具有陆地腐殖质样物质的土壤中类蛋白组分更高(与低聚缩芳烃结构和高含氧官能团有关)[5]；例如，不同植物来源的藻类为主的沉积物和大型植物为主的沉积物，藻类为主的沉积物中DOM类蛋白质物质多于大型植物为主的沉积物中的DOM(C峰强度较低的藻类衍生DOM具有高蛋白低腐殖质的特征)[9]；例如，不同产生来源的DOM，水中陆生源DOM含有的芳环结构多于自生源DOM，其腐殖化程度、芳香性、疏水性高[10]；例如，不同地区的土壤，黑龙江黑土、四川紫土和浙江红土的DOM腐殖质样物质较多，贵州黄土和广东、广西红土的芳香度较低，微生物源蛋白样成分C3比例较高[4]；例如，不同时段的来源，冬季DOM中的类色氨酸主要来源陆地和长江口，夏季海水输入增多，光化学降解增多，微生物利用活性有机物增加，类腐殖质C4(峰值M)发生明显变化等[11]，不同的来源导致DOM的分子结构千差万别。EEM-PARAFAC方法涉及荧光EEMS采集、数据处理和PARAFAC拟合两种算法，两种算法都是根据荧光组分(荧光团)的相对组成生成指纹[12]。通过绘制得分矩阵，将成分得分相似的水样分组，可对不同来源水样进行客观分类。该方法相比较现在大量使用的稳定同位素分析方法而言，虽无法溯源至具体某一种物质，但EEM-PARAFAC分析方法不必对各污染源与污染地点的物质进行比对、追踪和分析校对，就可将污染物的来源方向判定清楚，之后通过有针对性地使用同位素等其他方法进行定向追踪，可大大节省了时间和精力成本。表1为EEM-PARAFAC分析DOM后得到几种来源的组分情况。

表1 荧光光谱参数描述

未来通过对不同来源数据(土壤、河流、废水、生物粪便、雨水等)的不断补充，EEM-PARAFAC方法已被广泛应用于土壤和水体的研究中，且因其易于实时监测，未来将逐渐成为各方面辨别污染物来源的便捷方法之一，通过查询数据库得知有机质的主要来源和未来应重点关注区域内的治理方向。

2 DOM分子结构

荧光强度和荧光峰都与结构之间关系密切，而荧光峰、荧光强度又与性质和活性官能团密切相关，所以结构的研究有利于进一步了解和分析DOM在整个环境中的迁移转化及作用机理和规律，进而研究多种物质与DOM相互作用，深入了解DOM在环境中的变化行为，为今后的相关环境研究和修复提供科学依据。

利用EEM-PARAFAC对DOM分子结构的研究已被广泛使用，因EEM-PARAFAC不仅可分离出荧光峰的种类，同时还可确定荧光峰的强弱，跟踪芳香族胡敏酸分子的分子大小变化，从而对DOM进行定性和定量的分析。通过EEM-PARAFAC技术，DOM在结构上的部分相关研究如表2所示。

随着环境、来源等外界条件的改变和影响，DOM各组分中的结构与成分都会发生一定的改变，从而致使DOM显现出不同的性质。例如，腐殖质分子在碱性溶液中呈现出线性结构，暴露出许多别的试验中未检测到的荧光基团[23]；城市区域DOM以类腐殖质物质为主，占比达到61.3%，而城乡结合区域由于受到更多的生活污水排放的影响，类蛋白质物质的比例最高，为59.4%(羧基官能团、芳环氨基酸和芳香结构的占比差异，芳香结构在某种程度上可打破π*→π转变等)[24]。这一系列的影响改变了分子结构，而分子结构的不同又会造成波长的蓝移和红移、荧光强度的强弱变化的不同以及荧光峰的不同等。反之，也可通过荧光峰的不同、荧光强度的不同、波长位移的变化，推理出分子结构的变化。

“素养”一词的含义比“知识”和“技能”更加宽广。“知识”与“技能”主要涉及具体学科领域的知识和基本技能，而素养是一个复杂的结构，其所涉及的内涵并非单一维度，而是多元维度的。核心素养不仅仅是知识技能，更重要的是正确的价值观念、必备的品格和关键能力。

通过观察光谱中各组分的波长，会发现光谱中常常出现从较长的波长区域逐渐移到较短的波长区域(蓝移)，从较短的波长区域逐渐移到较长的波长区域的现象为红移现象，对此类现象的解释有：发射波长发生红移，表明分子量和共轭部分增加，但具有脂肪族部分的π-π系统较少或共轭系统较少[25]；色氨酸残基被蛋白质包裹时，发射光谱可能发生蓝移[25-26]；微生物荧光峰发生蓝移，是因为一些芳香环被酸和碱分解、转化为更小的片段[23]。前人早已经归纳得出蓝移和红移是因为羧基、羰基、氨基、烷氧基等官能团含量的增多或减少。蓝移和稠环芳烃的分解、减少和大转小分子的结构相关(线性结构变成非线性结构、荧光波长变短、π电子系统的减少、羰基、羟基和氨基等官能团的消失、链状结构及芳香环上共轭基团的减少等)；而红移则是与分子量[4]、芳香性[27]、共轭部分[25]和特定荧光基团(羰基、羧基、羟基和氨基等)等部分的增加相关。

对于荧光强度，以羟基、甲氧基、氨基等低芳香性和刚性、共平面性结构为主的相对分子质量小的DOM产生的荧光强度较强，反之，分子结构以羧基、羰基等吸电子基团为主的相对分子质量大的DOM产生的荧光强度较弱。而对于荧光峰，部分研究表明Em<380 nm的荧光峰是基于含苯环的荧光团(如羟基和氨基)，Em>380 nm的荧光峰则是基于多环芳族的结构[26]。此外，也有研究表明不同波长的荧光峰与DOM中各组成分有关，例如较短的激发和发射波长荧光峰与简单的芳香蛋白质类物质有关(酪氨酸)，较长激发波长和短发射波长荧光峰与溶解性微生物代谢产物有关(类酪氨酸、类色氨酸、类蛋白质等)，长激发和发射波长荧光峰与类腐植酸有关，短激发波长和长发射波长荧光峰与类富里酸物质有关等[27-29]。

分子结构是导致DOM各种反应的关键因素，通过针对DOM的分子结构特质，可将物质表面的峰值及荧光强度等参数变化、本身所具有的特征与内在结构变化相结合，从而进一步深入挖掘DOM分子结构与其他功能特征变化之间所存在的相关性及差异性[27-29]。

3 DOM降解

DOM的降解对环境中诸多污染物的降解具有一定的影响作用，也是NOM生物地球化学循环研究的关键，探究DOM降解机理和影响因素，对人类生存发展和环境保护以及为建立合理的生态风险评价和相关污染物的防控措施具有重要意义。光降解和生物降解举例如表3所示。

表3 EEM-PARAFAC在DOM降解研究的应用

自然界中，DOM的降解主要可分为生物降解和光降解两种降解方式。二者都是对DOM进行降解，但相较而言，光降解DOM的降解速度和芳香度的还原速度都强于生物降解[36]。

DOM的生物降解，是指微生物对DOM的利用，维持其生命活动。生物降解与光降解最大的区别在于，生物降解主要降解DOM中的类蛋白组分，例如通过EEM-PARAFAC的荧光成分可知对生物降解的抗性为腐植酸样组>酪氨酸样组>色氨酸样组[37]；生物降解焦化废水DOM中的类蛋白质物质会高于类腐殖质，因为类蛋白由氨基蛋白酶和多肽等较为简单分子结构、分子缩合度较低的有机物质组成，易于降解[38]。单一讨论生物降解DOM中的蛋白质，仍然会出现多种情况，例如生物降解率都随陆地衍生芳香族化合物比例的增加而降低[39]；亲水性类蛋白比疏水性类蛋白更易于被微生物降解；铜绿微囊藻和背星囊藻相比较卵形隐藻释放的类蛋白，前者更易降解[40]，这都与不同来源的DOM内在结构相关。总之，生物降解DOM多数会让其腐殖化程度增加、芳香性减小、不饱和度降低、氧化程度增加、极性增加等。

结果显而易见，降解DOM的整个过程都受到了各种各样因素的影响，但各种因素最终是通过改变DOM的分子结构和官能团，从而影响DOM的降解效果。通过EEM-PARAFAC的各组分荧光强度和组分变化情况，就可准确得出其中哪部分物质发生变化，但该分析方法并不能对分子结构的具体变化进行详细描述和呈现，这时就需要结合红外光谱等方法进一步分析。

4 吸附络合

DOM参与了各种关键的环境和生态过程，特别是在重金属(HMs)和持久性有机污染物的生物地球化学循环和运输过程中。在有机污染物、HMs等物质和DOM的作用中，其作用力多种多样，例如范德华引力、静电吸引、π-π共轭效应、疏水性作用、电子给体/电子受体和阳离子桥等[46]，但EEM-PARAFAC方法，能较为准确地评估和分析它们之间的反应，EEM-PARAFAC方法已成为探索机制的重要工具，它们不仅可以减少重叠峰的干扰，还可以提供抗生素、HMs等物质迁移、对生物的毒性、生物利用度等定性、定量和特异性的相关指标[47]。这里主要介绍抗生素、HMs与DOM之间的吸附络合反应。

DOM与抗生素的吸附反应受多方面的影响，但不同的抗生素与DOM作用的组分不同，例如罗克沙胂(ROX)、磺胺喹诺啉钠(SQ-Na)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、土霉素(OTC)、四环素(TC)和红霉素(ERY)等都对DOM中的酪氨酸类和色氨酸类的成分(类蛋白组分)有显著的猝灭反应，其中SMZ优先与DOM中类酪氨酸成分作用，之后是类色氨酸[48]。主要与类腐植酸组分有较为明显的猝灭反应有双酚A、卡马西平等，布洛芬等则主要同类富里酸有猝灭反应[46]。DOM中的O-H、C-H、C-O、N-H、酰胺I和酰胺II，以及芳香族化合物和脂肪族化合物都可与TC反应，蛋白质样荧光团的活性位点酰胺和脂肪族主要与DOM络合的官能团，因此，类蛋白质与TC络合产生的猝灭效应最为明显[9]。传统的类腐殖质相比较类色氨酸组分，磺胺甲恶唑(SMX)主要与类腐殖质反应，腐植酸的-COOH基团能吸附SMX的-NH2并与之反应，Li等[49]猜测是因为SMX的外层是吸电子基团的磺酰胺苯环，这导致苯中不存在电子态，使其成为π电子受体。类似地，胡敏酸的-OH、-O和-NH2是给电子基团，苯骨架富含电子，并且也是π-π电子给体，因此，SMZ可以被π-π电子供体和受体两者吸附，SMX的N-H易于在胡敏酸表面共享来自H+的电子，并形成弱氢键；SMX的结构中有两个S=O带，它们是电子不足的，容易与胡敏酸的-COOH和-OH形成氢键。

但众多研究已然表明，大多数的抗生素对含有苯环和给电子基团的类蛋白质物质(Em<380 nm的荧光峰)的猝灭效应(NOM的微环境和构象的变化)高于含有多环芳烃结构的腐殖质物质(Em>380 nm的荧光峰)[9]。不同种类的抗生素与DOM的反应不同，举例如表4所示。

表4 EEM-PARAFAC在DOM与抗生素反应的研究应用

DOM与金属的络合反应，同样受多方面因素的影响，例如含有许多与金属结合的酚类、羟基和羧基官能团的天然非晶态交联芳香三维聚合物木质素所衍生的腐植酸能与金属离子发生较好的络合反应。但酚类(-OH)、氨基、羧基、羟基和羰基等官能团(配位体)及含量在其中发挥十分重要的作用。例如铜与DOM的反应，与分布于低分子量DOM中类腐殖质和类富里酸的结合亲和力高于分布于高分子量DOM中类蛋白的反应，其原因归功于芳香族酸性官能团(酚羟基、酚类位点)的存在，而铜与其中的腐殖质反应，腐殖质中高分子量组分因具有较高芳香性，拥有更多的结合电位，因而结合亲和性高于低分子量的芳香性组分[52-53]；铅和Ca(Ⅱ)与类腐植酸的亲和力高于类富里酸，其中Ca(Ⅱ)主要与其中的羧基类官能团结合；Cd(Ⅱ)与类富里酸组分的络合能力强于类蛋白组分，也强于腐植酸组分的络合能力，其归因于Cd(Ⅱ)主要与DOM中的羧基发生络合作用，在类富里酸组分中有大量羧基官能团、少量酚羟基官能团，而类蛋白组分中则含有大量酚羟基官能团、少量的羧基官能团[19]；Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)主要与类腐殖质和类富里酸组分芳香族和羧基类结合，也可选择性芳香类、类羧基类和酚类结合[54]，其中Fe(Ⅲ)先与胡敏酸中的腐殖质组分络合，Fe(Ⅲ)与酯键合、醌型环、芳族基团、脂肪族基团和酚基反应[55]。一般情况下，金属与DOM中的强点位酚羟基、含氮和含硫基团结合能力更强，因而大多数的金属与类蛋白组分(含氮组分)的络合能力更强[56]。

DOM的吸附络合反应中，分子结构和官能团在其中扮演着重要的角色。在不同的环境条件下(pH、金属浓度、来源、分子量、金属种类等)都是通过改变金属和DOM分子结构(官能团)的相关属性来达到改变二者的相互作用，举例如表5所示。

表5 EEM-PARAFAC在DOM与金属反应的相关应用

5 结论

EEM技术结合PARAFAC方法能对NOM进行定性和定量的分析。本文简述了EEM-PARAFAC在有机质4个方面：来源、分子结构、降解机理和吸附络合的研究，发现分子结构可揭示和指引研究NOM与污染物相互作用的机理和研究方向发展。未来可通过EEM-PARAFAC对分子结构的进一步研究，将复杂多样化的问题简单化和系统化，将大大促进污染物与有机质反应的相关研究进展。本文对EEM-PARAFAC在有机质相关方面的研究内容结合分子结构，进行了部分归纳和总结，为今后NOM三维荧光光谱指纹数据库的建立、NOM组分荧光特性指标标准的统一、污染物的快速识别分析和研究去除提供一定的帮助。