蒋春艳

(龙岩市农业科学研究所, 福建龙岩 364000)

生物防治中应用较广的微生物主要有绿僵菌Metarhiziumspp.、球孢白僵菌Beauveriabassiana和蜡蚧轮枝菌Verticilliumlecanii等[1]。绿僵菌属MetarhiziumSorokin隶属于真菌门Eumycota,丝孢科Hyphomycetaceae。该属真菌是一类非常重要的环境微生物[2],1879年Metchnikoff首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利丽金龟AnisopliaaustriacaHerbst,此后绿僵菌就成为了害虫微生物防治的主角之一[3]，并成为生防领域的研究热点之一。绿僵菌侵染寄主是寄主与病原菌之间生理生化相互作用的结果[4],其中包括寄主保护酶类活性发生一定变化。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是昆虫体内3种重要的保护酶。SOD几乎存在于所有有氧呼吸的生物体内,是一类重要的保护酶[1]。但是SOD稳定性不高,外界温度的变化、外源物质的侵入等都易导致SOD活性丧失[1]。POD存在于动植物体的细胞中,主要功能是催化过氧化物对各种物质的氧化,是一类以过氧化氢为电子受体的氧化还原酶,可以通过消除毒性物质和过氧化氢对细胞起到保护的作用[1]。CAT催化细胞内过氧化氢的分解防止其过氧化,从而起到防御作用,是一种重要的机体保护酶[1]。李世广等[5]研究了菜青虫Pierisrapae感染金龟子绿僵菌后体内几种保护酶活性的变化,结果表明,用金龟子绿僵菌处理后菜青虫体内SOD、POD和CAT均呈现先上升后下降的趋势,反映出菜青虫在金龟子绿僵菌侵染初期防御能力增强,后期降低。王伦等[6]用印楝素处理的食物喂养光肩星天牛Anoplophoraglabripennis成虫,结果表明SOD活性呈现先升高再降低的趋势,在第3天时达到最高,但处理组的酶活性一直都略高于对照组。宋漳等[7]研究发现马尾松毛虫Dendrolimuspunctatus3～4龄幼虫被金龟子绿僵菌侵染后1～4 d,体壁组织以及血淋巴中POD活性均有明显的减弱趋势。林忠莲等研究发现磷化氢对谷蠹Rhyzoperthadominica、玉米象Sitophiluszeamais成虫体内的CAT活性有明显的抑制作用[8]。刘玉娣等[9]用抑太保处理小菜蛾Plutellaxylostella幼虫5 h后2、3、4龄幼虫的CAT活性降至最低,证明小菜蛾2、3、4龄幼虫的 CAT和 POD活性与耐药性存在着一定的相关性。杀虫剂可通过干扰昆虫体内的相关酶活性来扰乱昆虫的防御体系,使昆虫不能正常代谢,直至死亡[10-13],因此农药对昆虫体内相关酶活性的抑制能力是衡量其防治效果的重要指标。

黄曲条跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)是十字花科蔬菜上的一种重要害虫。目前其在我国福建、广东和台湾等地大量发生[14],阻碍蔬菜正常生长或影响其品质,造成一定经济损失。由于黄曲条跳甲成虫善于跳跃,极易躲避杀虫剂,造成防效下降。农民为了控制该虫的为害,加大用药量,增加用药频率,从而加速了其抗药性的产生和发展。绿僵菌是对黄曲条跳甲有高致病力的病原菌[15]。由于绿僵菌侵染率高,对人畜环境安全,且可大量繁殖,可作为防治黄曲条跳甲的生防菌。目前有关绿僵菌侵染昆虫后昆虫体内保护酶活性变化方面的研究也有不少,而金龟子绿僵菌侵染黄曲条跳甲后保护酶活性方面的研究少见报道。本研究通过测定金龟子绿僵菌CQMa421处理黄曲条跳甲后其体内保护酶活性的变化,探讨黄曲条跳甲与金龟子绿僵菌相互作用机理,为寻找黄曲条跳甲抗药性治理措施,延缓其抗性发展,及黄曲条跳甲绿色防控提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试虫源

黄曲条跳甲成虫从福建省龙岩市蔬菜种植基地和龙岩市农业科学研究所植保室蔬菜大棚中十字花科蔬菜上采集,蔬菜种植基地在采集黄曲条跳甲前至少15 d未喷施农药,植保研究室蔬菜大棚中蔬菜播种后未喷施农药。采集的成虫于室内以新鲜未施用药剂的‘上海青’叶片饲养72 h,饥饿2 h以上再进行药剂处理, ‘上海青’(隆之喜种业有限公司生产)种植于龙岩市农业科学研究所植保室大棚。

1.1.2供试药剂及试剂

80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂(OD)，重庆聚立信生物工程有限公司生产。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、过氧化物酶(POD)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒均为苏州科铭生物技术有限公司产品。

1.1.3真菌分离及分生孢子悬浮液配制

将金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂接入PDA培养基,放入培养箱于(25±1)℃和L∥D=12 h∥12 h下培养并进行多次分离纯化。纯化后的金龟子绿僵菌经培养产孢后,将分生孢子粉刮下,用含0.1%吐温-80的无菌水,配成1.6×109个/mL孢子悬浮液,待用。

1.2 方法

1.2.1试虫处理

采用浸叶法处理试虫。金龟子绿僵菌CQMa421孢子悬浮液用无菌水配制成5个浓度,即1×108、2×108、4×108、8×108、1.6×109个/mL。将新鲜、未施用任何药剂的‘上海青’叶片在孢子悬浮液中浸渍约15 s后取出,自然晾干后置于透明塑料瓶中,每瓶接入200头左右虫龄、大小一致的黄曲条跳甲成虫,用80目防虫网封口,置于温度(25±1)℃、相对湿度70%～80%,光周期L∥D=14 h∥10 h的人工气候箱内,以含0.01%吐温-80无菌水作空白对照,分别于24、48、72、96 h和120 h时取出活虫大约0.1 g,放入冰箱冷冻用于酶活性测定。

1.2.2酶液制备

准确称取0.1 g试虫放入研磨杯中,加入 1 mL 酶提取液,冰浴下进行组织匀浆。于4℃下,8 000 r/min离心10 min,取上清液作为酶源,置于冰上待测。

1.2.3酶活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性测定均按试剂盒说明书进行。SOD活性测定:将90 μL待测酶液和各测试试剂按顺序加入测定管中充分摇匀,室温静置30 min后加入1 mL玻璃比色皿中,测定各管560 nm下吸光度;POD活性测定:工作液在25℃恒温水浴锅中预热10 min以上,将50 μL待测酶液和950 μL工作液加入1 mL玻璃比色皿中混匀,测定470 nm下1 min时和2 min后的吸光度,将每毫升反应体系中每分钟OD470变化0.01定义为1个酶活力单位;CAT活性测定:将工作液在25℃恒温水浴锅中预热10 min,将35 μL待测酶液和1 mL工作液加入1 mL石英比色皿中混匀,室温下立即测定240 nm下初始吸光度和1 min后的吸光度，将每克组织每分钟催化1 nmol H2O2降解定义为1个酶活力单位。

1.3 数据处理

试验结果采用Excel 2007进行数据统计,数据以平均值±标准误差表示;DPS软件进行方差分析和Tukey法多重比较进行差异显著性分析,利用Excel 2007作出酶活性图表。

2 结果与分析

2.1 金龟子绿僵菌对黄曲条跳甲体内SOD活性的影响

由图1可得出,不同浓度金龟子绿僵菌CQMa421处理黄曲条跳甲成虫后,其体内SOD活性出现不同程度的变化。120 h内,各浓度处理后,SOD活性都呈现先升高后降低的趋势,在48 h时SOD活性显著增强,与其他时间点测得的活性值差异显著(P<0.05),到120 h时恢复到接近24 h时的活性,而空白对照组在测定期间SOD活性差异不显著,处于动态平衡状态。

图1 金龟子绿僵菌处理黄曲条跳甲后体内SOD活性变化Fig.1 Changes of SOD activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

不同浓度金龟子绿僵菌CQMa421处理后，同一时间点测得的黄曲条跳甲SOD活性不同。各处理组在24 h时SOD活性略低于对照,对照组为62.23 U/g,处理组按处理浓度由低到高其SOD活性分别为60.63、58.6、60.37、60.03 U/g和59.1 U/g,各处理组间差异不显著。48 h时各处理浓度下SOD活性都显著高于对照,处理浓度越高,SOD活性越高,其中浓度1.6×109个/mL金龟子绿僵菌CQMa421处理后黄曲条跳甲SOD活性达76.67 U/g,为对照组的1.21倍,各处理间存在显著差异(P<0.05)。72 h开始SOD活性出现下降趋势,到120 h时各处理组SOD活性回到对照水平。

2.2 金龟子绿僵菌对黄曲条跳甲体内POD活性的影响

金龟子绿僵菌CQMa421孢子悬浮液处理黄曲条跳甲后72 h内不同浓度处理在同一时间点测得的POD活性差异不显著，且同一浓度处理的POD活性随时间也没有显著变化，但处理后96 h时各处理组POD活性均达到峰值,即浓度1×108、2×108、4×108、8×108、1.6×109个/mL 孢子悬浮液处理后POD活性分别为1 020、1 066.67、1 240、1 086.67 U/g和1 166.67 U/g,显著高于其他时间的POD活性，也显著高于对照的POD活性(306.67 U/g)，分别为对照的3.33、3.48、4.04、3.54倍和3.80倍；到120 h时POD活性恢复到对照水平。对照组120 h内POD活性较稳定,各时间点无显著差异(图2)。

2.3 金龟子绿僵菌对黄曲条跳甲体内CAT活性的影响

金龟子绿僵菌侵染后，黄曲条跳甲体内CAT活性总体表现为先上升并在处理后120 h时恢复至正常水平,对照组在不同时间CAT活性差异不显著。各处理组CAT活性随时间变化差异较大。1×108、2×108、4×108个/mL处理在48 h,8×108个/mL和1.6×109个/mL处理在72 h CAT活性上升达到最大值，其中8×108个/mL金龟子绿僵菌处理后，CAT活性由48 h的107.52 nmol/(min·g),上升到72 h的116.96 nmol/(min·g),为同时间对照的1.13倍,随后降低;96 h时,浓度为1×108、2×108、4×108个/mL处理组CAT活性较72 h有所升高;120 h时,各处理组CAT活性均降低(图3)。

图2 金龟子绿僵菌处理黄曲条跳甲后体内POD活性变化Fig.2 Changes of POD activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

金龟子绿僵菌处理后24 h,黄曲条跳甲CAT活性略高于对照;48 h时CAT活性开始上升,除浓度为8×108个/mL外,其他处理组都显著高于对照;72 h时浓度为8×108和1.6×109个/mL处理组显著高于其他处理和对照(P<0.05),120 h时所有处理组CAT活性下降,除浓度为1.6×109个/mL外,其他处理组CAT活性与对照相当。

图3 金龟子绿僵菌处理黄曲条跳甲后体内CAT活性变化Fig.3 Changes of CAT activity in Phyllotreta striolata treated by Metarhizium anisopliae

3 结论与讨论

昆虫细胞内活性氧的产生与清除主要靠SOD、POD和CAT三者协调调控,当昆虫受到外界各种胁迫时可以诱导昆虫体内这3种保护酶含量升高,协同调控作用使活性氧处于动态平衡状态,以降低活性氧自由基对机体的伤害,维持昆虫正常生长发育。黄训兵等研究了4种植物源化合物对亚洲小车蝗Oedaleusasiaticus保护酶活性的影响,结果显示保护酶活性均与对照差异显著[16];宋程飞等研究了绿薄荷Menthaspicata茎、叶乙醇提取物对小菜蛾幼虫3种保护酶的影响,结果表明,随着提取物作用时间的增加,小菜蛾体内3种保护酶活性均表现为先升高后下降[17];张胜兰等研究了蝉花IsariacicadaeSLGY-2 对斜纹夜蛾Spodopteralitura生长发育及体内保护酶活性的影响,结果表明,斜纹夜蛾在抵御蝉花SLGY-2 侵染过程中,虫体内3种保护酶均出现应激反应,且随着菌株孢子浓度增加,酶活性逐渐上升,但最终表现为下降[18];李会平等测定了桑天牛Aprionagermari幼虫感染白僵菌后体内主要保护酶活性的变化,结果表明,桑天牛幼虫感染白僵菌后,体内SOD、POD和CAT活性在接种初期迅速提高,但在接种后期均出现不同程度下降[19]。

本文研究不同浓度金龟子绿僵菌处理黄曲条跳甲不同时间对SOD、POD和CAT活性的影响,结果表明,金龟子绿僵菌处理后黄曲条跳甲体内SOD、POD和CAT 的活性均有升高,并出现一定的变化规律。黄曲条跳甲取食处理叶片后,24 h内金龟子绿僵菌孢子还未萌发,SOD活性与对照组相差不大,或低于对照;随着取食时间增加,孢子萌发并在黄曲条跳甲体内繁殖,O2浓度增加,虫体内的HO-浓度增加,虫体迅速作出免疫防卫反应,48 h时SOD为被激活且活性明显上升,以减轻过氧离子对虫体的毒害,随后金龟子绿僵菌在虫体内大量繁殖,使得SOD合成受到抑制,自我防卫能力迅速下降,表现为SOD活性急剧下降,120 h时回到正常水平。前期可能由于金龟子绿僵菌产生的毒素少,POD活性在72 h内上升很缓慢,随着金龟子绿僵菌孢子在体内大量繁殖,毒素急剧增加,机体迅速启动免疫系统使POD活性快速上升,以维持机体正常生理功能,96 h到达最高值,随着毒素在体内越集越多,使得POD合成受阻,活性逐渐下降。金龟子绿僵菌处理48～72 h时，黄曲条跳甲CAT活性上升到最高,但最终不敌金龟子绿僵菌在体内的生长和增殖速度,所以侵染后期CAT活性逐渐下降,最终黄曲条跳甲走向死亡,低浓度处理组CAT活性出现了一定的反弹,这可能是昆虫抵御有毒物质的抗性反应,生产上我们应该再施一次药,或者增加处理浓度,以提高防治效果。本文结果与前人研究结果基本一致。可见,这3种保护酶在黄曲条跳甲抵抗绿僵菌引起的氧化胁迫中发挥了重要作用。本试验初步分析了金龟子绿僵菌 CQMa421 对黄曲条跳甲3种保护酶活性的影响,其对黄曲条跳甲的生防潜力还需进一步研究。