单鼎城, 赵亚男, 张美惠, 马明慧, 韩志国, 刘 伟*,范洁茹*, 袁军海, 周益林

(1. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193; 2. 河北北方学院农林科技学院, 张家口 075000; 3. 慧诺瑞德(北京)科技有限公司, 慧诺表型实验室, 北京 100096)

小麦白粉病是由禾布氏白粉菌小麦专化型Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的气传性病害,当小麦叶片受到白粉菌侵染后,叶绿素含量会显著下降,且感病后不同时间和严重度下叶绿素含量的变化有所不同[1-2]。因此,通过叶片中叶绿素含量的变化可以了解植物所受病害胁迫的程度。但传统上,叶绿素含量的测量主要采用紫外分光光度法,该方法操作繁琐,而叶绿素荧光技术可以直接、快速地通过叶绿素荧光反映出叶绿素的变化,以此作为生物胁迫检测的依据。近年来,随着叶绿素荧光测定和成像技术的进步,尤其是叶绿素荧光成像系统的开发,提出了一种从宏观上获取植物荧光的方式,在获取荧光参数的同时也获得了快速、直观和精确的图像信息,这使得叶绿素荧光成像技术克服了传统荧光仪有限点测量的缺点,因而逐渐被广泛应用。陈兵等[3]对棉花黄萎病(Verticillium wilt)胁迫下的棉花叶片进行叶绿素荧光检测,结果发现利用叶绿素荧光监测棉花黄萎病是可行的;许培磊等[4]的研究发现,葡萄霜霉病菌Plasmoparaviticola侵染离体山葡萄Vitisamurensis叶片后3 d,其光系统活性就发生了显著变化;Mandal等[5]利用叶绿素荧光技术检测发现,轻度感染霜霉病与重度染病的圆苞车前Plantagoovata叶片的Fv/Fm值相较于健康叶片分别降低了24.39%和44.90%。已有研究发现,利用叶绿素荧光成像技术可以实现烟草感染辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus)或感染黄瓜炭疽菌Colletotrichumorbiculare后感病程度检测[6-7];Cen等[8]利用叶绿素荧光成像技术对感染黄龙病菌CandidatusLiberibacter的柑橘叶片进行诊断,诊断准确率最高可达97%;Bauriegel等[9-10]利用叶绿素荧光图像技术分析了受黄色镰孢Fusariumculmorum侵染后的麦穗损害程度和病害分布情况。这些研究均表明,利用叶绿素荧光成像技术来监测植物病害胁迫是可行的。

在小麦白粉病方面,利用激光诱导叶绿素荧光(laser-induced chlorophyll fluorescence)监测小麦叶片受白粉病侵染的程度已有研究报道[11],而叶绿素荧光成像技术在小麦白粉病监测研究中鲜有报道。为了探究叶绿素荧光成像技术在小麦白粉病监测中的可行性,本研究在室内对接种6个不同浓度的小麦白粉病菌分生孢子的小麦离体叶段、一叶一心幼苗及二叶一心幼苗进行叶绿素荧光测定,初步明确图像以及图像参数与病情严重度之间的关系,为该技术在小麦白粉病监测中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦品种为‘京双16’(高感小麦白粉病)。小麦白粉病菌菌株为混合菌株,由中国农业科学院植物保护研究所小麦白粉病组提供;多功能植物光合表型测量系统PlantExplorerPro(荷兰PhenoVation公司)由慧诺表型实验室提供。

PlantExplorerPro仪器相关参数分别为:相机传感器类型为CCD,相机分辨率为130万像素,单张叶绿素荧光图像获取时间为20～1 000 μs,激发光强度在25 cm处为1 500～6 000 μmol/(m2·s),在60 cm处为800～3 500 μmol/(m2·s),且强度可调。成像面积为40 cm×53 cm。

1.2 试验方法

1.2.1试验设置和接菌浓度梯度处理

本试验分别选取小麦幼苗期离体叶段、一叶一心期幼苗、两叶一心期幼苗进行叶绿素荧光成像监测。各时期小麦培养条件基本一致。各时期小麦均在(18±1)℃,光周期L∥D=16 h∥8 h条件下的温室或培养箱内培养。

小麦幼苗离体叶段的准备:将‘京双16’小麦品种种植在用玻璃罩罩起的塑料盆内(防止污染),待小麦第1叶完全展开时,在无菌条件下将叶片剪成长约4 cm的叶段,整齐摆放入10 cm×10 cm方形培养皿中的水琼脂培养基上,每皿15个叶段。

一叶一心期和两叶一心期小麦幼苗的准备:将‘京双16’小麦品种种植在用玻璃罩罩起的塑料盆内,每盆按照“一”字形种10株麦苗,待小麦苗长至一叶一心及两叶一心时备用。

孢子悬浮液的准备:将新鲜的重为4、8、12、16 mg 和20 mg的孢子粉分别置于喷壶中,倒入4 mL 电子氟化液,涡旋振荡15 s,混匀后进行喷雾接种。

接菌处理:各处理均设置6个浓度的白粉病菌分生孢子悬浮液,用电子氟化液配制的0(对照)、1、2、3、4、5 mg/mL的小麦白粉病菌分生孢子悬浮液,其中离体叶段上每个接菌浓度设置4个重复(4皿),一叶一心、两叶一心期小麦苗上每浓度设置3个重复(3盆),每个重复喷3 mL分生孢子悬浮液,在无菌操作台内按浓度梯度由低到高接菌,然后将各处理随机排列置于(18±1)℃培养箱或温室内培养。

病害调查:在进行叶绿素荧光成像检测的当天,逐个对叶片进行白粉病发病情况调查,按病斑面积占叶片面积的百分率记录严重度(0～100%),并计算每个浓度处理的平均严重度。

1.2.2叶绿素荧光图像采集和处理

分别于接菌后的第3、5、7天和第9天利用PlantExplorerPro多功能植物光合表型测量系统对不同时期以及接种不同浓度病菌分生孢子的小麦离体叶段或幼苗进行叶绿素荧光成像检测(为了减少干扰,提高测量的准确性,盛放参试材料的托台均用黑色幕布包裹),开始检测之前,参试材料需在无光的植物测量室内暗适应20 min,测量结束后文件保存为DAT文件格式。

利用PlantExplorerPro系统自带的Data Analysis Software分析软件对相应的图像进行分析,首先利用Mask功能将不发叶绿素荧光的背景去除,主要是将小麦离体叶段的培养皿、一叶一心幼苗和二叶一心幼苗的盆以及背景杂物全部隐去,只在图像中留下清晰的离体叶段或麦苗。然后利用ROI模块将植物图像进行分割,分别导出分割图像或者全图像的叶绿素荧光图像参数。通过Data Analysis Software数据分析软件分析处理可以得到暗适应下最大光化学量子产量(Fv/Fm)、非光化学淬灭系数(NPQ)、光化学淬灭系数(qP)、叶绿素指数(Chlidx)等4个参数。

1.3 数据分析

病菌分生孢子不同接种浓度梯度下小麦离体叶段、一叶一心幼苗、二叶一心幼苗的叶绿素荧光参数Fv/Fm的多因子方差分析和差异显著性分析分别采用SAS(9.4)软件的PROC GLM和PROC ANOVA模块完成。接种后第5、7、9天的离体叶段、一叶一心期幼苗、二叶一心期幼苗的小麦白粉病病情严重度与其对应的叶绿素荧光参数值之间的相关性分析采用SAS软件的PROC CORR模块完成。利用SAS软件的PROC REG模块建立不同时期下基于Fv/Fm和Chlidx的小麦白粉病严重度估计模型,并利用决定系数(R2)和均方根误差(RMSE)来检验拟合程度。

2 结果与分析

2.1 白粉病菌分生孢子不同接种浓度下小麦离体叶段的叶绿素荧光图像变化

在接种白粉病菌分生孢子后的第3、5、7、9天对小麦离体叶段进行叶绿素荧光图像采集,获取Fv/Fm图像(图1)。Fv/Fm图像中的荧光信息分布比较均匀,1 mg/mL分生孢子的接菌处理随着接菌时间的延长没有明显的差异,表明在病菌分生孢子浓度低时,离体叶段的荧光强度保持在一个相对稳定的范围;而2～5 mg/mL分生孢子处理的Fv/Fm荧光信息在小麦白粉病显症之前(接菌后第3天),染病叶段的叶表面Fv/Fm荧光信息变化相对较小;Fv/Fm在显症初期(接菌后第5天)开始变化,且在接菌后第7天和第9天(此时叶片已明显出现症状)表现出一定的差异,尤其是在病斑侵染严重的区域,荧光信息显示为红色,染病叶段的Fv/Fm图像强度分布会随着发病程度的增加而出现明显红色加深的变化。

图1 接种不同浓度白粉菌分生孢子后小麦离体叶段的Fv/Fm图像Fig.1 Fv/Fm-images of detached leaf segments of wheat inoculated with Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt) spores with different concentrations

2.2 小麦不同生长时期和白粉病菌分生孢子不同接种浓度梯度下Fv/Fm的比较

对不同接种浓度下小麦离体叶段、一叶一心幼苗、二叶一心幼苗的叶绿素荧光参数Fv/Fm的多因子方差分析结果表明,分生孢子浓度对Fv/Fm值的影响均达极显著水平(P<0.01);接种后天数仅对小麦幼苗离体叶段Fv/Fm有显著影响,而对一叶一心幼苗和两叶一心幼苗的Fv/Fm无显著影响;接种浓度和接种后天数两因子交互作用对离体叶段和一叶一心幼苗Fv/Fm无显著影响,而对两叶一心幼苗Fv/Fm影响达到显著水平(表1)。

接种白粉病菌分生孢子后的第3天时,离体叶段、一叶一心幼苗以及两叶一心幼苗的Fv/Fm值随接种浓度的变化规律均不明显,而在接种后第5、7和9天时,在3个时期下Fv/Fm值均随接种浓度的增加而下降(图2)。

通过对离体叶段、一叶一心幼苗、二叶一心幼苗在不同接菌浓度下第5、7、9天时的荧光参数Fv/Fm的差异显著性分析发现,分生孢子浓度对不同时期小麦叶绿素荧光参数Fv/Fm值有一定影响,除一叶一心幼苗用1～2 mg/mL孢子悬浮液处理时其Fv/Fm值与未接种对照处理没有显著差异外,其他处理的Fv/Fm值均显著低于对照(表2)。

表1 小麦不同生长时期和白粉病菌不同接菌浓度下Fv/Fm的多因子方差分析1)

表2 接种不同浓度白粉病菌分生孢子条件下叶绿素的Fv/Fm1)

图2 接种不同浓度白粉病菌分生孢子后不同天数的Fv/Fm箱线图Fig.2 Fv/Fm boxplot of different days after inoculation with different concentrations of Blumeria graminis f.sp. tritici spores

2.3 小麦白粉病病情严重度与荧光参数的相关性

通过分析接种后第5、7、9天的离体叶段、一叶一心幼苗、二叶一心幼苗的小麦白粉病病情严重度与其对应的叶绿素荧光参数值(表3)的关系,发现Fv/Fm、Chlidx随接菌浓度的升高有逐渐降低趋势;而接菌浓度越高,病情严重度越大;qP和NPQ随接菌浓度变化规律不明显。

进一步对小麦白粉病病情严重度与其对应的叶绿素荧光参数之间的相关性(表4)分析可以看出,所选叶绿素荧光参数Fv/Fm和Chlidx与病情严重度之间均存在极显著负相关关系,且两个参数在离体叶段和一叶一心幼苗期与病情严重度之间的相关系数明显高于两叶一心幼苗期。qP在离体叶段和两叶一心期与病情严重度显著负相关,而在一叶一心幼苗期与病情严重度未达到显著相关性。

2.4 小麦白粉病病情严重度与叶绿素荧光参数的关系模型

在相关性分析的基础上,选取接种后第5、7、9天的叶绿素荧光参数Fv/Fm和Chlidx,分别建立不同时期下基于Fv/Fm和Chlidx的小麦白粉病严重度估计模型(表5)。结果可以看出,两个参数在离体叶段、一叶一心幼苗期、两叶一心幼苗期所建模型拟合效果均达到极显著水平(P<0.01),但在两叶一心幼苗期所建模型拟合效果相较离体叶段和一叶一心幼苗期所建模型略差。

通过对基于两个参数所建模型拟合效果(图3)比较发现,在同一时期基于叶绿素荧光参数Fv/Fm或Chlidx所建模型的拟合度相似,所建病害估计模型的R2基本相等,且同一时期分别基于Fv/Fm和Chlidx所建模型的理论值和实际观察值之间的均方根误差(RMSE)比较接近,因此,叶绿素荧光参数Fv/Fm或者Chlidx用来估计苗期小麦白粉病病情发生情况是可行的。

表3 小麦不同生长时期和不同接菌浓度下小麦白粉病病情严重度及荧光图像参数的动态变化1)

表4 小麦白粉病病情严重度与叶绿素荧光参数之间的相关关系1)

3 结论与讨论

叶绿素荧光成像技术是一种快速、无损伤研究植物逆境光合生理的理想方法,已有的研究表明,病害胁迫可以降低棉花[3]、山葡萄[4]、烟草[12]等植物叶绿素荧光参数Fv/Fm值。本研究中,小麦叶片受到白粉病菌侵染后其Fv/Fm图像颜色分布会随着病害侵染程度的加重而发生改变,且Fv/Fm值显著低于未接菌叶片,这表明利用叶绿素荧光图像参数来监测小麦白粉病的严重程度是可行的。

小麦白粉病病情严重度与叶绿素荧光参数Fv/Fm和Chlidx之间均存在极显著负相关关系,这是因为白粉病菌的侵染会造成小麦叶片叶绿素含量的下降[1],从而导致Chlidx的下降;已有研究发现,病菌的侵染会使PSⅡ(光系统Ⅱ)受到伤害,造成叶片PSⅡ潜在活性中心受损,光合电子由PSⅡ反应中心向电子受体A、B及质体醌库的传递过程受到很大的影响,从而表现为Fv/Fm值降低[3, 7]。两个参数在离体叶段和一叶一心幼苗期与病情严重度的相关系数明显高于两叶一心幼苗期,这可能是因为两叶一心麦苗叶片相对较长,且第2叶与第1叶有一定的重叠或者遮挡,从而产生干扰所致。进一步通过对Fv/Fm与Chlidx参数所建模型拟合效果比较发现,所建病害估计模型的R2基本一致,因此,叶绿素荧光参数Fv/Fm或者Chlidx用来估计小麦苗期白粉病病情发生情况具有一定的应用前景。

叶绿素荧光成像技术在研究植物病害胁迫以及在病害检测和监测方面具有巨大的应用潜力,与传统的人工调查等病害诊断方法相比,叶绿素荧光成像技术具有快速、客观、无损伤等特点,而且可以早期检测到病菌的侵染及程度。本研究发现,在接菌后第3天进行叶绿素荧光检测时Fv/Fm值变化不明显,而在接菌后第5天(开始显症期)时Fv/Fm值表现出随接菌浓度的增加而下降的趋势,表明叶绿素荧光成像技术对于还未显症，尚处于潜育期的小麦白粉病菌可能也有一定的检测能力,但具体在病菌侵染后第几天可以检测到以及检测能力的大小,还有待于进一步研究。