刘 叶，孙爱玲

（壹诺（天津）检测服务有限公司，天津 300383）

氯霉素[1-2]作为一种典型的抗生素，在畜牧业、水产养殖、家禽饲养等行业得到了广泛应用。但氯霉素具有一定的毒性，会对人们的血液系统造成损害，甚至有可能引起再生障碍性贫血，且该症状是不可逆的。因此，氯霉素的毒副作用引起了人们的重视，如何减少氯霉素的使用频率也成为了热点话题。为了减少该药品的滥用对于人们造成的伤害，国家相关部门于2002年发布农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》，对该药品的使用进行了严格的规定，氯霉素及其相关化学品被禁止在食用动物上使用。随后，发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第五批）》（整顿办函〔2011〕1号）明确规定肉制品中不得检出氯霉素。

测量不确定度是一个非负参数[3-10]，用来表明实验中测量的结果之间所存在的分散性。此外，由于检测实验中会出现一定的测量误差，不确定度的测定有助于提高检测结果的准确性和可信度。本文结合相关资料[11-15]，依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）、《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）、《化学分析中不确定度的评定指南》（CNAS—GL006：2019）等相关文件对液质联用法测定香肠中氯霉素的不确定度进行了评定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo Fisher TSQ Quantis 液相色谱-质谱仪：配电喷雾离子源；ME 204分析天平；JW-2022HR冷冻离心机；XW-80A混合仪、HSC 24 B氮吹仪。

氯霉素标准品，纯度≥99.24%；氘代氯霉素内标；乙腈，HPLC级；无水硫酸钠、无水氯化钠，分析纯；HyperSep Retain-PEP SPE 柱；0.45 μm有机相滤膜；实验室一级水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取50 mg氯霉素于100 mL容量瓶中，缓慢加入乙腈溶液并定容，得到氯霉素标准储备液（500 μg·mL-1）。然后于 10 mL 容量瓶中加入 20 μL标准储备液并使用乙腈定容，得到标准中间液（1 μg·mL-1）。使用移液枪抽取 5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和500 μL标准工作液于提前准备好的5支不同容量瓶（10 mL）中，并在其中均加入1 mL氘代氯霉素作为内标工作液，定容，得到一系列氯霉素浓度为 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的标准溶液，其中氘代氯霉素的浓度为 10 ng·mL-1。

1.2.2 测定方法

称5 g绞碎均质的香肠样品于50 mL离心管中，加内标液100 μL，加入3 mL水和一粒陶瓷均质子，混匀，加入乙腈 5 mL，涡旋并置于冷冻离心机中10 000 r·min-1离心5 min，将上清液倒入另一50 mL离心管，在残渣中再加入ACN 5 mL，重复提取一次，两次上清液倒入同一离心管，随后加入4 g Na2SO4和 1 g NaCl，涡旋，8 000 r·min-1离心 5 min。活化萃取柱，将离心后的溶液转移至固相萃取柱，收集流出液。40 ℃的条件下，氮气吹干，1 mL水定容，过0.45 μm膜测定。

1.3 不确定度模型

不确定度数学模型为

式中：X为试样中待测组分残留量，μg·kg-1；C为样液中待测物的浓度，ng·mL-1；V为试样定容体积，mL；m为样品称样量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

从测定过程和确定的数学模型进行分析，氯霉素测定不确定度的来源有以下8方面：①氯霉素标准储备液和中间液配制产生的不确定度；②容量瓶引入的不确定度；③移液枪引入的不确定度；④标准工作曲线拟合产生的不确定度；⑤样品称量产生的不确定度；⑥样品定容体积产生的不确定度；⑦样品重复测定引起的不确定度；⑧液质联用仪引起的不确定度。

2.2 浓度C引入的不确定度urel(C)

2.2.1 重复性引起的不确定度urel(C1)

对样品中的氯霉素含量进行重复测定，测定结果见表1。其标准偏差为S=重 复 测定产生的标准不确定度为u(C1)=0.026 4 ng·mL-1，相对标准不确定度为：

表1 重复测量浓度C的数据结果表

2.2.2 标准物质引入的不确定度urel(C2)（1）氯霉素标准储备液和中间液配制产生的不确定度urel(C2标)。将50 mg标准品用色谱纯乙腈溶于100 mL容量瓶中，随后定容。氯霉 素 的 纯 度 为（99.23±0.77）%， 其 中k=2。 因此，由纯度的微小变化所引入的相对不确定度为

根据检定证书的内容可知，实验所用型号的天平允许误差通常是±0.5 mg，按均匀分布，则由称量准确度引入的标准不确定度和相对不确定度分别为

100 mL容量瓶定容引入的不确定度：100 mL容量瓶的误差范围是0.1 mL，按矩形分布，其标准不确定度为u(V100)=0.057 7 mL。室内温度为（20±5）℃，而由温度波动引起的体积变化通常是呈均匀分布的，k=乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3，由此可得到温度波动引入的标准不确定度为u(V100t)=0.395 mL。则100 mL容量瓶定容引入的相对不确定度为

10 mL容量瓶定容体积引入的不确定度：根据计量书所提供的数据，10 mL容量瓶体积变化的允许误差为±0.020 mL。按照矩形分布来计算相对不确定度，则为urel(V10)=0.001 2。由实验室内温度变化所导致容量瓶体积变化如上文所述，同理可得出温度引起的相对不确定度为urel(V10t)=0.003 95。则10 mL容量瓶定容体积引入的相对不确定度为

1 000 μL 移 液 枪 移 取 1 000 μL 溶 液 时 产 生的容量允许误差为±1%，按矩形分布，则移液枪移取体积所引入的相对不确定度为

因此，合成氯霉素标准储备液和中间液配制产生的相对不确定度为

（2）标准曲线配制过程产生的不确定度。①容量瓶引入的不确定度urel(V容)：容量瓶允许误差是±0.020 mL，按矩形分布，相对不确定度为

温度波动通常也会导致物体的体积产生一些细微的变化，进而影响测试的最终结果。本实验室内温度是（20±5）℃，体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，因此温度波动引入的相对不确定度为

②移液枪引入的不确定度urel(V器)：不同移液枪的不同量程，其允许的最大误差不同。即便是同样容量的移液枪，在量取不同体积溶液时也往往会出现不同的允许误差。例如，10 μL移液枪的允许误差为±8%；50 μL移液枪移取5 μL溶液时产生的误差为 ±8%、取50 μL 时为±3%；1 000 μL移液枪取100 μL溶液时产生的误差为±2%、取500 μL时为±l%。按矩形分布，可得到不同移液枪引入的相对不确定度为

式中：Vi为不同移液体积，μL；ti为容量允差误差；V器为移液枪规格，μL。

各相应移液体积的容量允许误差及相对不确定度见表2。

表2 移液枪移取不同体积溶液的相对不确定度表

2.2.3 标准工作曲线拟合产生的不确定度urel(CX)

氯霉素标准溶液的测定结果如表3所示，拟合可得Y=0.103 4X-0.008 157。

表3 氯霉素标准溶液的测定结果

则移液枪引入的相对不确定度为

故合成标准物质配制产生的相对不确定度为

式中：S(Y)为标准曲线的标准差；P为样品溶液的测定次数，P=10；N为标准溶液的测定次数，N=5；a为标准曲线的截距；b为标准曲线的斜率；Cx为样品溶液中待测物的浓度，ng·mL-1；c为标准溶液浓度的平均值，ng·mL-1；ci为校准标准溶液的浓度；Yi为单次标准溶液的响应值。

合成校准过程中产生的相对不确定度为

2.3 样品称量产生的不确定度urel(m)

对于5 g样品来说，天平称量时的最大误差范围是±0.000 5 g，按矩形分布，则样品称量产生的相对不确定度为urel(m)=0.000 058。

2.4 样品定容体积产生的不确定度urel(V样)

移 液 枪 导 致 的 不 确 定 度：1 000 μL移液枪容量允差是±1.0%，按矩形分布，则

温度波动引起的体积不确定度：温度波动（20±5）℃，所引起的体积变化呈均匀分布，溶 液 体 积 膨 胀 系 数 为 2.1×10-4℃-1， 故温度波动引起的体积相对不确定度为urel(V样t)=

2.5 液质联用仪引起的不确定度urel(Q)

根据仪器校准证书可知，u=6%，k=2，则相对标准不确定度为

2.6 标准不确定度的合成

将上述各分量合成相对标准不确定度为

经过10次重复试验，取平均值可以得出所测试样品中的氯霉素含量是0.98 μg·kg-1，由此可得

2.7 扩展不确定度及测定结果报告

95%置信概率下取包含因子k=2，将合成标准不确定度乘以包含因子计算得到氯霉素测量结果的扩展不确定度为

U=u(X)×k=0.085×2=0.17 μg·kg-1

因此，根据实验结果可报告表示为（0.98±0.17）μg·kg-1，k=2。

3 结论

本文使用液相色谱-质谱法对香肠中残留的氯霉素含量进行了检测，建立了合适的数学模型对不确定度进行计算模拟评估。结果表明，在香肠中氯霉素含量为0.98 μg·kg-1时，扩展不确定度是0.17 μg·kg-1，k=2。进一步分析可知，检测过程中引入不确定来源对实验结果有一定影响，主要影响因素包括标准储备液、中间液、标准溶液的配制过程，标准曲线拟合与仪器校准。与此相比，样品质量的准确称量、样品的多次重复测试等因素对实验结果的影响较小。因此，在实验中要保证仪器性能稳定，按时做好仪器日常维护保养，对移液器和容量瓶进行定期计量，选择精度高、灵敏度高的器械进行标准物质和标准曲线的配制，以期降低不确定度，提高测量结果的准确度，从而为科研和检测提供可靠的依据。