刘畅，李玉宝，左奕，李吉东

（四川大学分析测试中心，四川 成都 610065）

黄芩苷（baicalin，BA）是一种存在于黄芩植物根茎叶中的黄酮类化合物，具有抑菌、抗炎等生物活性，能够通过激活机体免疫系统识别、杀伤和清除肿瘤细胞。近年来，研究发现BA 可促成骨相关细胞的成骨分化。然而BA 为难水溶性药物，生物利用率低，大大限制了其临床应用。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA），化学式为Ca(PO)(OH)，是动物骨骼和牙齿的主要无机成分，因其具有良好的生物相容性、离子交换性和骨传导/骨诱导等性能，广泛用作骨修复材料和药物载体。使用羟基磷灰石负载BA，不仅可以起到局部缓释的目的，增加BA 在体内的局部生物利用率，还可赋予羟基磷灰石更好的成骨活性，在促进骨再生修复领域具有较大的应用潜力。目前，尚未有HA负载BA的相关研究报道。大量研究表明，BA 在强酸强碱、高温等环境中容易变性失活，所以选择合适的途径进行药物负载十分重要。

1 材料与方法

1.1 实验材料

磷酸肌酸、BA（纯度95%）购于大连美仑生物技术有限公司；磷酸缓冲液片剂购于北京索莱宝科技有限公司；硝酸钙[Ca(NO)·4HO]、磷酸三钠（NaPO·12HO）、聚乙二醇（PEG400）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钙（CaCl·2HO）及其他试剂均购于成都市科隆化学品有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平（BT25S，赛多利斯科学仪器有限公司，中国）；行星式球磨机（QM-3SP04，南京大学仪器厂，中国）；多通量密闭微波化学工作站（MDS-6G，上海新仪微波化学科技有限公司，中国）；小型喷雾干燥机（SPRAY-2000，上海熙扬仪器有限公司，中国）；智能恒温培养振荡器（HNY-100B，天津欧诺仪器股份有限公司，中国）；低速离心机（LD4-2A，北京雷勃尔离心机有限公司，中国）；真空冷冻干燥机（LGJ-12，北京松源华兴科技发展有限公司，中国）；扫描电子显微镜（SEM；JSM-6510LV，JEOL 公司，日本）；透射电子显微镜（TEM；Tecnai G2F20 S-TWIN，FEI 公司，美国）；X 射线衍射仪（XRD；DX-2500，丹东方圆仪器有限公司，中国）；傅里叶红外光谱仪（FTIR；Nicolet 6700，Thermo 公司，美国）；紫外分光光度计（UV-1000，翱艺仪器有限公司，中国）。

1.3 不同形貌羟基磷灰石合成与BA负载

1.3.1 nHA的合成

分别配制0.5mol/L 的四水硝酸钙和0.3mol/L 的十二水磷酸三钠水溶液，按照一定比例将钙源溶液缓慢滴加到磷源溶液中，在70℃水浴条件下以900r/min 速率快速剪切乳化1h，并用4mol/L 的NaOH 溶液调节溶液pH 稳定在10±0.1，持续搅拌1h确保反应完全，静置陈化24h后使用磷酸缓冲溶液（PBS）将羟基磷灰石清洗至pH为中性，离心后冷冻干燥获得纳米棒状羟基磷灰石。

1.3.2 mHA的合成

分别配制一定浓度的磷酸肌酸和二水氯化钙水溶液，按比例将磷源溶液缓慢滴加入钙源溶液中，滴加前使用1mol/L的NaOH溶液调节钙源溶液pH 稳定在10±0.1，持续搅拌1h，将混合好的溶液取40mL 转移至单个微波反应釜内密封，在120℃条件下反应30min，静置陈化，使用去离子水洗涤至pH 呈中性，离心后冷冻干燥获得微米球状羟基磷灰石。

1.3.3 nHA和mHA吸附负载BA

使用PBS 分别配制不同浓度的BA 溶液，取3mL 配制的BA 溶液放入塑料EP 管，称量5mg 的nHA 或mHA 加入溶液中并密封容器，置于恒温培养振荡器中震荡24h，离心后取沉淀冷冻干燥得到载BA 的羟基磷灰石，命名为“nHA/mHA+数字”，如nHA100 代表使用nHA 吸附载药时BA 溶液浓度为100µg/mL。

1.3.4 一步法制备负载BA的mHA

按照1.3.2节配制混合溶液，使用NaOH溶液调节混合液的pH分别为7.5、8、9和10，并在转移至反应釜的溶液中添加2mg的BA，反应后得到的载药羟基磷灰石分别命名为BHA(7.5)、BHA(8)、BHA(9)和BHA(10)，BHA 即BA-loaded Hydroxyapatite，括号内的数字代表反应时溶液的pH。

1.3.5 nHA喷雾干燥负载BA

配制100g/L 的nHA 悬浊液，球磨20min 后在进口温度150℃、出口温度60℃的条件下喷雾干燥，得到干燥的球状羟基磷灰石，命名为MHA（microspheric hydroxyapatite）。分别添加2.5%、5%和10%的BA至配制好的nHA悬浊液中，混合均匀后喷雾干燥，得到的载药球状羟基磷灰石分别命名为2.5MHA、5MHA和10MHA。

1.4 材料的理化和药物负载性能表征

将无水乙醇超声分散的样品粘在样品台上，喷金2min，采用SEM 在工作电压20kV，工作距离10mm的条件下观察样品形貌。采用TEM观察镀碳膜铜网上分散的样品的超微结构。采用X射线衍射仪对制备的颗粒进行物相分析，分析条件为Cu K射线源（=0.15418nm），管电压40kV，管电流25mA，扫描角度范围2=5°～80°，扫描速率为0.03°/min。采用傅里叶红外光谱仪对样品中所含官能团进行分析，扫描范围4000～400cm，分辨率0.05cm。通过Image J 软件随机测量SEM 图像视野中100 个颗粒的直径，并统计分析粒径分布。

采用紫外分光光度计在=275nm条件下对不同药物浓度的PBS 溶液进行吸光度检测，绘制出BA的标准曲线，通过检测1.3.3节中离心后的上清液的吸光度计算获得载药量。包封率由载药量进一步通过式(1)计算得出。

2 结果与分析

2.1 两种不同羟基磷灰石的理化性能

通过化学沉淀法和微波水热法制备了两种形貌的羟基磷灰石，nHA 和mHA。如图1(a)和(b)所示，nHA 呈均匀的短棒状，宽度约20nm，长度40～150nm，mHA呈类海胆状的微球，球的直径尺寸约为1.5µm。

FTIR光谱[图1(c)]证实nHA和mHA均具有羟基磷灰石的特征官能团。其中，3570cm处的峰归属于羟基磷灰石本身含有的羟基基团；3421cm和1635cm处的羟基的宽峰是样品粉末接触空气吸收水分所导致；1039cm、964cm、606cm和567cm处的峰属于PO3的特征峰；1415cm和1465cm处的峰属于CO2的不对称伸缩振动的双分裂峰，870cm附近为CO2的AB混合型取代面外弯曲振动特征峰，这三个峰的出现是由于合成过程中空气中的二氧化碳少量进入到磷灰石晶格中。

通过XRD[图1(d)]可以证实，样品粉末的主要衍射峰与羟基磷灰石标准卡片（JCPDS 09-0432）的特征峰基本吻合，可以在2为25.9°、31.678°、32.15°与33.989°处观察到对应(002)、(211)、(112)和(202)晶面的衍射峰，表明制得的nHA 和mHA 均为高纯度的羟基磷灰石，而且微量的CO2掺入并没有导致结晶相的明显变化。

图1 nHA和mHA的理化性能

2.2 nHA和mHA吸附负载BA

图2结果显示mHA具有更高的载药能力[(a)]和药物包封率[(b)]，这可能是由于羟基磷灰石微球表面具有丰富的介孔和较大的比表面积，有更好的药物吸附能力。因此，本文作者团队优选出mHA 为载体，考察载药时BA 的浓度分别为100µg/mL、1500µg/mL、3000µg/mL时对mHA载药行为的影响。

图2 nHA和mHA吸附负载BA的载药量和包封率

如图3(a)～(c)所示，mHA吸附负载BA后没有改变其本身的球状形貌，载药羟基磷灰石微球的粒径主要分布在1～1.5µm 之间[见图3(d)～(f)]。红外光谱[图3(g)]结果可以观察到载药mHA 出现了新的吸收峰，1660cm处的吸收峰对应黄酮类化合物的共轭羰基，1616cm是苯环C==C 键伸缩振动吸收峰，1589cm和1450cm处的吸收峰属于苯环骨架振动，1359cm和767cm处的吸收峰分别对应C—H对称弯曲以及苯环单取代C—H键引起的面外弯曲振动，表明mHA 通过吸附成功负载了BA，并且随着溶液中BA 浓度增大，载药微球显示出更强的属于BA的吸收峰。XRD谱图[图3(h)]结果显示吸附负载BA 没有改变微球状羟基磷灰石的晶体结构，因为药物负载量较少，也没有观察到明显的药物BA的衍射峰。

图3 不同BA浓度溶液中制备的载BA的mHA理化性能

尽管研究发现微球状羟基磷灰石较纳米棒状羟基磷灰石有相对更高的吸附载药效率，且这种吸附负载BA 的方式能最大程度地保证药物活性，但载药步骤烦琐、操作耗时。因此，需进一步寻找简便、高效的制备羟基磷灰石负载BA的新方法。

2.3 一步法制备载BA的羟基磷灰石微球

微波水热法能够克服传统水热容器加热不均匀的缺点，缩短反应时间，提高工作效率，避免羟基磷灰石的合成过程中存在滞后效应。由图4(a)～(c)可以看出，通过一步微波水热法制得的羟基磷灰石均呈现均匀的球形，然而BHA(10)呈现不均匀的团聚物形态[图4(d)]，出现大量不规则的沉淀物（箭头所指）。图4(e)～(g)表明微波水热法制备得到的BHA 具有微米级尺寸，粒径主要分布在1～1.5µm之间，而BHA(10)的团聚物却具有1.0～2.5µm的宽广分布[图4(h)]。XRD 谱图[图4(i)]结果显示，合成得到的BHA 在8°～26°范围内出现了不同程度的杂质峰（虚线框所示）。FTIR 结果[图4(j)]表明，不同pH 条件下合成的BHA 均没有检测到BA 的特征峰。这是由于前体溶液碱性较强，BA 会发生水解并析出沉淀，BA大量变性失活，BHA中BA的残余含量很低，FTIR 无法检测到BA 的特征吸收峰。

图4 不同pH条件下合成的载药mHA的理化性能

通过微波水热法一步制备负载BA 的微米球状羟基磷灰石虽然操作简单，但是BA 在前体溶液中极不稳定，容易分解成为其他物质，破坏了药物的结构，大大降低羟基磷灰石负载BA 的生物活性。因此，该方法不适合用于制备负载BA 的羟基磷灰石复合物。

2.4 喷雾干燥法制备负载BA的羟基磷灰石

喷雾干燥法是制备羟基磷灰石微球的方法之一，这种方法简单快捷，可以连续高效制得羟基磷灰石微球，易于工业化生产。SEM 观察[图5(a)～(h)]显示，MHA 和负载了不同含量BA 的MHA 均具有较好的球形，微球直径主要分布在2～8µm 之间[图5(i)～(l)]，BA的负载没有明显改变微球的形貌。

图5 喷雾干燥法制得的羟基磷灰石微球的SEM图像及粒径分布图

FTIR光谱[图6(a)]中观察到明显的BA特征吸收峰，证实了BA的成功负载及活性保持。XRD结果[图6(b)]显示，喷雾干燥负载BA的方式并没有改变羟基磷灰石的晶体结构，BA 可能主要以非晶形式分布在微球中，所以没有观察到BA 的特征衍射峰。TG 分析结果[图6(c)]显示，MHA 在550℃升温范围内有6.05%的质量损失，这是由于吸附水和结合水从样品中移除；而2.5MHA、5MHA、10MHA 在相同条件下除去失水外的实际质量损失分别为2.52%、5.53%、9.30%，这与三组样品中BA 的添加量基本一致，证明喷雾干燥的方法可以实现近100%的药物包封率。

图6 喷雾干燥法制得的MHA及负载BA的理化性能

喷雾干燥的方法避免了强酸强碱溶液对药物的影响，而且由于溶剂（去离子水）的沸点为100℃，BA 的熔沸点为233℃左右，调整进口温度介于水溶剂和BA 的熔沸点之间，既能够维持药物的稳定性，又可以保证成球和药物负载的效果。

3 结论

（1）FTIR 图谱分析、TEM 观测以及XRD 谱图结果表明，通过化学沉淀法和微波水热法合成的nHA 和mHA 均具有典型的羟基磷灰石晶体结构，两种羟基磷灰石的组成、结构无明显差别，形貌分别呈棒状和球状。

（2）载药量曲线、包封率曲线和FTIR 图谱等结果显示，nHA 吸附负载BA 的方法条件温和、结果稳定，然而步骤烦琐耗时，载药量和包封率较低。

（3）SEM 图像和XRD 谱图等结果表明，微波水热一步法合成负载BA 的羟基磷灰石微球的方式步骤简单，条件易控，但是BA 极易在前体溶液中失活，严重影响载药效果。

（4）本文通过喷雾干燥法制备负载BA 的羟基磷灰石微球，制备工艺简单，批次间重复性好，TG 失重曲线等结果证实该方法可以在维持药物活性的同时实现近100%的负载效率，适合实验室和工业的大规模生产。