王五权，范东升，李昊熙，孔菲，桑维钧，彭丽娟，卢燕回，杨茂发

（1.中国烟草总公司广西壮族自治区公司 南宁市 530022；2．贵州大学烟草学院 贵阳市 550025）

烤烟是我国重要的经济作物，其创造的巨大经济效益是各级地方财政和烟农增收的重要来源，在乡村振兴过程中具有重要作用。广西壮族自治区位于珠江上游的华南亚热带山地丘陵地带，气候温暖，光照充足，非常适合烤烟的生产，东北部的贺州市、北部的河池市和西部的百色市是广西主要的烤烟生产区，长期为工业企业提供大量优质的烟叶产品。但是，普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是当地烤烟生产的主要威胁之一，不仅严重制约广西烤烟产量，还直接影响了后续的烘烤调制过程，降低了烟叶产品的质量和分级，使企业和烟农蒙受了巨大经济损失[1]。

普通花叶病毒是一种正义单链核糖核酸（+ss-RNA）植物病毒，能够通过机械传播的途径侵染烤烟和其他多种农作物[2]。在上世纪90年代初广西烟区开展的普查工作中，贺州市和百色市烟区就发现TMV严重发生[3]，但在当时还不是广西烤烟的主要病毒病害[4]。到了本世纪初，TMV已经成为广西烟区分布最广、危害最大的病毒病害[5]。经过分子生物学和血清学的检测，TMV是广西烟区贺州市、百色市和河池市危害烤烟生产的优势病毒[6]。在后续贺州市开展的病毒病检测工作中，富川瑶族自治县和钟山县等烤烟产区利用血清学抗体，得到了TMV超过50%的检出率[7]。所以，掌握广西烤烟TMV的发生规律，对于绿色防控措施的开展有着重要的指导作用。

外壳蛋白是TMV病毒粒子同外界寄主植物和环境条件接触的关键成分，编码外壳蛋白的基因也是TMV基因组的重要区域[8]。外壳蛋白基因序列的多样性在很大程度上体现了病毒的多样性，也在一定程度上解释了病毒的传播规律。通过分析外壳蛋白基因完整序列的多样性，发现贵州毕节烟区5个地点采集到的TMV具有较高的亲缘关系，并且与烟田周边同属茄科的马铃薯上采集的TMV存在联系[9]；借助小RNA文库建设进行的外壳蛋白序列系统发育分析表明湖南烟区的TMV具有较高的多样性，可以划分为多个类群，并且分别同国内外不同地区的参考序列存在亲缘关系[10]；而关于广西烟区TMV的多样性和系统发育关系的研究仍比较缺乏。本研究针对广西烟区贺州市、百色市和河池市的烤烟种植区，以外壳蛋白的完全序列为靶标，借助其他地区的TMV序列为参考，分析广西烟区TMV的多样性，解释TMV的发生规律，为该种病害的防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 感病毒烟叶样品

2021年3月上旬至6月下旬，在广西壮族自治区的烤烟生长季节，多次赴贺州市、百色市和河池市的烤烟种植区开展病毒病等病害的调查。其中，在烟叶病毒病发生严重的5月和6月的两次病害调查中，从富川瑶族自治县、钟山县、靖西市和南丹县的烟田采集到具有明显花叶病症状的烟叶样品若干，用自封袋分别保存并做好标记。在邻近烟田的烟叶站的检测室，用Agdia®免疫试纸条（北京中检葆泰生物技术有限公司）进行烟叶病毒的血清学检测，得到感染TMV的烟叶样品17个，样品信息如表1所示。将样品带回实验室，以备后续操作处理。

表1 广西烟区17个感染TMV的烟叶样品编号及采集信息

1.1.2 主要试剂

0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液，日本BBI公司产品；RNeasy® Plant Mini Kit试剂盒，德国Qiagen公司产品；4S Green Plus无毒核酸染料，上海生工生物产品；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，美国Thermo Scientific公司产品；2X SanTaq PCR Master酶，上海生工生物产品；DNA分子量标准（100-1 000 bp），上海生工生物产品。

1.2 试验设计

1.2.1 总RNA提取与逆转录

撕取感染TMV烟叶的叶肉组织一片（重量约为100 mg），在0.1%的DEPC溶液处理过的研钵中用液氮充分碾磨后，迅速将烟叶组织粉末加入处理过的1.5 mL离心管中，用Plant Mini Kit试剂盒进行样品总RNA的提取。最终RNA产物用试剂盒配套的30μL去RNA酶水溶解。提取过程的操作均在通风橱中的冰盒上进行，移液器、枪头和离心机等相关仪器设备均用0.1%的DEPC溶液提前处理过。每一个样品使用不同套的研钵和研杵，避免样品RNA的交叉污染。取5μL的总RNA样品在1%的琼脂糖凝胶（含1/10 000核酸染料）中进行电泳30 min，电泳电压110V，电泳后的琼脂糖凝胶在成像仪中观察所提取RNA的质量与降解程度。

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录。每个样品提取2μL总RNA作为模板，采用25μL反应体系，试剂配方为：1μL的Ribo Lock RNase Inhibitor(20 U/μL)，1μL的RevertAid MMuLV RT(200 U/μL)，1μL的Random Hexamerprimer，2μL的dNTP mix(10 mM)与4μL的5×Reaction Buffer。整个反应体系在42°C下反应60 min合成DNA链，然后在70°C下反应5 min终止反应。反应得到的各个样品的cDNA供后续反应使用。

1.2.2 TMV外壳蛋白位点的选择与PCR设计

GenBank中TMV的标准基因组为1982年测序，登录号为NC_001367，长度为6 395 bp，编码6个基因[11]。其中，编码外壳蛋白基因的区域是第5712至6191位核苷酸，共480个碱基。针对这一区域，利用NCBI平台的Primer-BLAST工具（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）设计包含完整外壳蛋白基因的特异性引物一对：TMV5590F（5’-CGGTCAGTGCCGAACAAGAA-3’）和TMV6282R（5’-ATTTAAGTGGAGGGAAAAACACT-3’），由上海生工生物合成。

1.2.3 外壳蛋白序列的扩增与测序

利用设计的引物扩增广西烟区17个TMV样品的cDNA中的外壳蛋白片段。PCR反应体系（25μL）包括：各个样品的cDNA模板1μL，上下游引物（浓度10 mM）各1μL，Taq酶（2X SanTaq PCR Master）13μL。反应程序为：95°C退火5 min，然后进行30次扩增循环，每个循环包括95°C退火30 s、55°C退火30 s与72°C延伸30 s三个反应步骤，最后72°C延伸5 min。PCR反应在PCR仪（Biometra Tone 96G）中进行。取用PCR产物5μL在1%的琼脂糖凝胶（含1/10 000核酸染料）中进行电泳40 min，电泳电压110V，电泳后的琼脂糖凝胶在成像仪中观察反应结果。PCR产物使用引物TMV5590F和TMV6282R进行双向Sanger测序，每个TMV的双向序列在软件DnaSP 6（Universitat de Barcelona）中整合为一致序列。

1.2.4 TMV的系统发育分析

为了进一步理清我国各个烤烟种植区TMV系统关系，在GenBank中选择1条邻国韩国烤烟的TMV外壳蛋白区域完整序列为外群，从GenBank中下载我国黑龙江、山东、湖南、贵州和云南等其他省份烤烟的TMV外壳蛋白区域完整序列8条作为参考，来源地区和登录号详细信息见表2。利用MEGA 7软件[12]的MUSCLE模型[13]将广西烟区的17条与其他地区的9条TMV外壳蛋白完整序列进行核苷酸的序列比对，之后利用Tamura-Nei模型[14]重建26条序列之间的极大似然（Maximum-Likelihood,ML）系统发育关系，重建过程Bootstrap检验值设置为1 000。

表2 9条TMV外壳蛋白参考序列来源地区和GenBank登录号信息

2 结果与分析

2.1 TMV感病样品的cDNA

将从广西烟区贺州、百色和河池采集到的17个仅感染TMV的烤烟叶片样品存放于-20°C冰柜中。从样品中提取出的含TMV核酸的总RNA亮度大、含量高，降解不明显。将其逆转录成为cDNA样品，完成标记后，存放于-20°C冰箱中。

2.2 外壳蛋白片段的序列

利用本研究设计的引物TMV5590F和TMV6282R与相对应的PCR程序，从广西烟区17个TMV样品的cDNA中扩增出长度约为700 bp的条带，如图1所示。经过PCR产物双向Sanger测序及双向序列的一致性整合，并以TMV的标准基因组序列（NC_001367）为参考，获取广西烟区17个TMV样品480个碱基的外壳蛋白区域完整序列（NCBI的序列号为OK481731-OK481747）。

图1 广西烟区17个TMV样品的含外壳蛋白区域的片段条带凝胶成像图

2.3 广西烟区TMV系统发育分析

基于外壳蛋白区域完整序列的广西烟区17个TMV样品的系统发育关系如图2所示，外群韩国的TMV外壳蛋白与我国样品的核苷酸序列相似度小于76%，氨基酸序列相似度小于85%，在系统发育树上也明显分歧开。我国的TMV样品，核苷酸序列相似度大于96%，氨基酸序列相似度小于98%，在系统发育树上也聚集在一起。对于广西烟区的样品，贺 州 市的4个TMV样 品FFY-1、FFY-2和ZGA-1、ZGA-3具有完全相同的外壳蛋白核苷酸序列，它们同该市的另一个样品FSJ-2核苷酸仅有1个同义突变的碱基差异，在系统发育树上也呈现聚集。河池市的2个TMV样品NLZ-1和NLZ-3在系统发育树上也相邻，它们的核苷酸序列有98%的相似度，其中只有2个位点是非同义突变。百色市的样品在系统发育树上的聚集关系不明显。其中4个样品JDG-1、JHD-2、JHD-4和JHD-6同上述贺州市的5个TMV样品、河池市的2个样品以及贵州铜仁GZ-TR和黔西南GZ-XN的2个参考序列的核苷酸序列相似度大于98%，非同义突变只有1个，也在系统发育树上聚集在一起，体现了较近的亲缘关系。百色市另外2个来自同一地点但采样时间不同的样品JHD-1和JHD-5具有完全相同的外壳蛋白核苷酸序列，并且与云南红河烟区（YN-HH）的参考序列的核苷酸仅具有3个同义突变位点。2个采样时间相同但分别来自同德和地州的样品JTD-5与JDP-1具有1个同义突变的碱基差异，它们分别与来自相同地点的同德JTD-2和地州JDG-1存在大于1%的核苷酸序列差异和至少1个非同义突变位点。除此之外，贺州富川的FSJ-2、百色靖西的JHD-6与河池南丹NLZ-1具有完全相同的外壳蛋白核苷酸序列，这个序列同其他地区的参考序列均存在差异。

图2 广西烟区17个TMV样品（标记有“#”号）的外壳蛋白区域核苷酸序列与其他地区的9条序列的极大似然（Maximum-Likelihood,ML）系统发育关系

3 小结与讨论

经过对外壳蛋白基因序列的系统发育分析，广西烟区的TMV样品中，贺州市的FFY-1、FFY-2、FSJ-2、ZGA-1和ZGA-3共5个样品，河池市的NLZ-1和NLZ-3共2个样品与百色市的JDG-1、JHD-2、JHD-4和JHD-6共4个样品聚集在一起，这部分广西的TMV样品贵州铜仁GZ-TR和黔西南GZ-XN的2个参考序列有一些亲缘关系，但是同黑龙江、山东、湖南、云南和贵州毕节的参考序列均具有差异。其中，贺州富川的FSJ-2、百色靖西的JHD-6与河池南丹的NLZ-1具有相同的外壳蛋白序列。这反映了广西烟区TMV的独特性。而在广西的不同地区之间，贺州的TMV亲缘关系很近，同贵州毕节烟区的TMV具有类似的情况[9]。贺州富川富阳的FFY-1和FFY-2与钟山公安的ZGA-1和ZGA-3外壳蛋白序列完全一样，同富川石家的FSJ-2存在仅有1个同义突变的碱基差异，它们也应该来自一个相同的传染源。这些亲缘关系接近的TMV在较大范围内的传播，据推测可能是通过打顶抹芽等人为操作引起[3]，必须在今后的栽培中加强管理。河池的TMV亲缘关系较近，南丹六寨的NLZ-1和NLZ-3存在较高亲缘关系，其中NLZ-3同相邻的贵州黔西南的参考序列完全一样，与贵州铜仁的参考序列存在较小差异，在一定程度上反应了TMV传播在地域上的接近性。而百色市的TMV则具有很高的多样性，而且同样品的采集来源地点的对应性不大，这些结果与湖南烟区TMV的研究结果相似[10]。靖西化峒的2个样品JHD-1和JHD-5尽管采样时间不同，但是具有相同的外壳蛋白基因序列，它们同云南红河的参考序列也比较接近，但是同化峒的其他3个样品JHD-2、JHD-4和JHD-6就存在比较大的差异。靖西同德的1个样品和地州的1个样品具有一定的亲缘关系，它们采样的时间相同，但是又分别与同样来自同德和地州的其他样品存在比较大的差异。这些均表明百色市TMV具有多个不同的传播来源，可能存在不同的传播途径。综上所述，广西烟区的TMV存在着不同于其他地区的独特类群，而在不同地区之间存在着不同程度的多样性，体现了TMV传播途径的差异。