石亚其 雷玉华 王 勇 张 倩

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

我国血管疾病的发生率和病死率不断上升，给社会带来了沉重的医疗负担［1］。急性心肌梗死（AMI）在心血管疾病中最为严重，寻找安全有效的AMI防治策略具有重要的临床意义［2］。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是新近发现的炎症介质，由215个氨基酸构成，包含2个同源性DNA结合区（A盒和B盒）以及一个负性C末端［3］。HMGB1几乎存在于所有细胞的细胞核和细胞质中，是一种高度进化保守的非组蛋白DNA结合蛋白。HMGB1作为DNA伴侣能稳定核小体，参与DNA的复制和修复，调控基因转录和调节甾体类激素受体的活性等［4］。心肌缺血时，HMGB1可由坏死和损伤的心肌细胞被动释放，或由活化的单核/巨噬细胞主动分泌，升高的HMGB1通过激活下游信号通路直接诱导合成分泌白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子，进一步损伤心肌组织［5］。胡椒碱是黑胡椒与长胡椒中的一种酚类物质，能够发挥抗氧化、抗炎、免疫调节等多重药理功效［6］。近年来，有研究发现胡椒碱可通过减轻炎症反应而改善缺血性心肌病损伤，但目前针对胡椒碱防治AMI的研究甚少［7］。因此，本研究拟观察胡椒碱对AMI大鼠的心脏保护作用并探究其对HMGB1、IL-1β和IL-6水平的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SPF级雄性SD大鼠（年龄8周），购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：11400700041438，动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养环境光线明暗交替，湿度（40±10）%，温度（25±2）℃。本实验经过恩施土家族苗族自治州中心医院伦理审查委员会的批准（批准号：20200012A）。

1.2 试药与仪器

胡椒碱（纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，货号：A0200）。IL-1β ELISA试剂盒（Elabscience公司，货号：E-EL-R0012c）；IL-6 ELISA试剂盒（Sigma公司，货号：RAB0311）；HMGB1 ELISA 试剂盒（Elabscience公司，货号：E-EL-R0505c）；TTC试剂（Sigma公司，货号：17779）。电子天平（上海良品仪器厂）；低温高速离心机（日本Hitachi公司）；石蜡包埋机及切片机（德国Leica公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；多功能图像分析系统（德国Leica公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；小动物呼吸机（上海奥尔科特公司）；兽用心电图机（理邦精密仪器公司）；涡旋震荡仪（无锡沃信仪器制造有限公司）。

1.3 分组与造模

将SD大鼠60只随机分为5组，每组12只，即假手术组、模型组、胡椒碱低剂量组（10 mg/kg）、胡椒碱中剂量组（20 mg/kg）、胡椒碱高剂量组（30 mg/kg）。从胸骨左缘第3～4肋打开胸腔暴露心脏，用4-0丝线穿过大鼠左室前降支（LAD）起始部，通过拉紧丝线方式阻断LAD，心电图示ST-T抬高提示建模成功。假手术组只穿线不结扎，腹腔麻醉大鼠，行气管插管，监测大鼠心电图情况。

1.4 给药方法

在AMI模型建立成功后即刻，胡椒碱低、中、高剂量组分别予胡椒碱10、20、30 mg/kg，假手术组、模型组给予10 mL/kg的生理盐水，连续灌胃7 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 TTC染色检测心肌梗死面积 末次给药后2 h，用2%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，充分暴露大鼠右颈静脉，然后从右颈静脉缓慢推入约1 mL TTC液。15 min后从右颈静脉推入10%氯化钾1 mL并取出心脏，-80℃条件下冰冻10 min。取出心脏，沿垂直心脏左室长轴纵向切成2 mm左右的薄片，并将心脏切片放入多聚甲醛中固定显色，最终白色为梗死区域，根据白色区域面积占比大小评估梗死情况。

1.5.2 病理形态学分析大鼠心肌损伤 4%多聚甲醛固定心肌组织72 h后，将心肌组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋等过程制成石蜡块。制作的石蜡切片经苏木精及伊红染色后，用二甲苯和无水乙醇透明，透明的切片最后滴上中性树脂封片，并在光学显微镜下观察。

1.5.3 ELISA法测定HMGB1、IL-1β及IL-6水平 将心肌组织匀浆后，以2 000 r/min，4℃条件下离心20 min，留取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中HMGB1、IL-1β及IL-6水平。

1.6 分子对接

使用Autodock Vina 1.1.2进行分子对接，以研究胡椒碱与HMGB1之间的结合情况。从RCSB蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/）下载HMGB1的3D结构（PDB ID：4QR9）。从TCMSP数据库下载（https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）胡椒碱（Molecule ID：MOL001592）的3D结构。运用AutoDockTools软件将胡椒碱与HMGB1进行分子对接，通过Flexible Docking模块分析分子间的结合位点及能量。设置参数时，“能量最大评价次数”设定为2 500 000，运行次数设定为10，其他参数为默认值。使用PyMoL进行可视化分析（http：//www.pymol.org/）。

1.7 统计学处理

应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示。多组差异比较采用单因素方差分析，组间差异进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理改变

相较于假手术组，手术组心肌变性紊乱，细胞间质水肿，同时伴有炎性细胞浸润。胡椒碱预处理能使心肌病理得到较好的改善，且这种改善呈剂量依赖性。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理改变（HE染色，100倍）

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较

见表1。TTC检测心肌梗死面积发现，胡椒碱各剂量组心肌梗死面积小于模型组，有统计学差异（均P＜0.05），且梗死面积胡椒碱高剂量组＜中剂量组＜低剂量组。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较（%，±s）

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较（%，±s）

注：与模型组比较，#P＜0.05；与胡椒碱低剂量组比较，*P＜0.05；与胡椒碱中剂量组比较，&P＜0.05。下同。

组别假手术组模型组胡椒碱低剂量组胡椒碱中剂量组胡椒碱高剂量组n5 5 5 5 5心肌梗死面积0 56.78±8.98 45.12±6.03#38.17±4.91#*30.36±3.92#*&

2.3 各组大鼠心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平比较

见表2。与假手术组相比，模型组HMGB1、IL-1β及IL-6表达水平升高（均P＜0.05）。胡椒碱预处理能呈剂量依赖性地降低HMGB1、IL-1β及IL-6表达水平（均P＜0.05）。

表2 各组大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠HMGB1、IL-1β、IL-6表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.05。

组别假手术组模型组胡椒碱低剂量组胡椒碱中剂量组胡椒碱高剂量组n 5 5 5 5 5 HMGB1（μg/L）74.08±4.11 145.24±10.45△130.99±8.58#△114.82±7.05#△*100.33±6.12#△*&IL-1β（ng/L）0.66±0.18 2.65±0.69△1.83±0.55#△1.32±0.37#△*1.01±0.23#△*&IL-6（ng/L）0.45±0.06 1.43±0.31△1.05±0.18#△0.83±0.16#△*0.68±0.07#△*&

2.4 胡椒碱可靶向结合HMGB1

采用分子对接方法分析了胡椒碱与HMGB1的结合能力，两者之间的结合能预测为-8.01 kcal/mol，这提示胡椒碱可靶向结合HMGB1。见图2。

图2 胡椒碱可靶向结合HMGB1

3 讨论

本研究结果表明，AMI后心肌HMGB1、IL-1β及IL-6水平显著增高，而胡椒碱呈剂量依赖性地缩减心肌梗死面积，改善心肌细胞变性坏死，降低HMGB1、IL-1β及IL-6水平。同时分子对接分析表明胡椒碱与HMGB1有较强的靶向结合能力。这些结果表明，胡椒碱能对AMI后的心肌发挥保护作用，其作用可能是通过靶向结合HMGB1，降低HMGB1、IL-1β及IL-6的表达来实现的。

大量实验研究已证实，IL-1β、IL-6等炎性因子在心肌IRI的发生发展过程中起到重要作用［8］。HMGB1被证实为一种含量丰富的非组蛋白核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快的特性而得名，HMGB1在细胞内可促进基因转录，稳定核小体、促进DNA重组、复制和折叠，调控转录过程［9］。当HMGB1释放到细胞外成为机体的一种“危险信号”时，即可在许多严重炎症性疾病中扮演至关重要的角色，比如败血症、急性肺损伤、风湿性关节炎等［10-12］。近年来研究发现，HMGB1在心肌梗死及心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病的发生和发展过程中同样起着重要的作用［13-14］。最近，我们的研究发现稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者血清HMGB1表达明显增高，并且与冠状动脉狭窄程度成正相关。Dong等［15］证实缺血再灌注大鼠心肌HMGB1的表达与IL-1β和IL-6的表达成显著正相关，进一步表明HMGB1可促进多种炎症因子的表达和释放。此外，有研究证实IL-6能够刺激巨噬细胞释放HMGB1并呈时间和剂量依赖性，表明两者可以形成正反馈，共同促进炎症发展［16］。以上研究结果提示HMGB1与其他促炎因子之间存在着一种相互促进释放的正反馈效应，可在多种疾病的发生和发展过程中起着关键作用。

相关理论认为，AMI等缺血性心肌病存在血瘀病证。多项药理研究表明，胡椒碱具有通瘀血，改善缺血性损伤及抗炎等药理活性［17］。Guo等发现胡椒碱可通过减轻炎症反应而对大鼠冠脉结扎后引起的心肌缺血损伤发挥保护作用［18］。宋思维等报道胡椒碱可有效降低过氧化氢所致心肌细胞炎症反应［19］。本研究结果表明，胡椒碱可以降低AMI后心肌中HMGB1、IL-1β及IL-6的高表达，从而减小心肌梗死面积，发挥心肌保护作用。

分子对接作为一种研究药物分子和受体之间相互作用的方法，可从理论上模拟并预测药物分子与受体的结合模式和亲合力，已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术［20］。一般来说，分子与靶点结合能越低表示分子间结合得越稳固，交互作用可能性越高，结合能＜0 kcal/mol时分子与靶点具有结合能力，结合能≤-5.0 kcal/mol时结合得较好，结合能≤-7.5 kcal/mol结合得非常好［20］。本研究发现，胡椒碱与HMGB1两者之间的结合能为-8.01 kcal/mol，这提示胡椒碱可很好地靶向结合HMGB1从而影响其介导的促炎因子释放。胡椒碱对HMGB1的直接靶向作用进一步解释了胡椒碱降低AMI心肌中HMGB1及相关炎症因子表达的原因。总之，本研究初步探讨了胡椒碱对AMI心肌的保护作用及可能的机制，为AMI的药物治疗提供了新思路。