傅 奕，陈帮明，李 鑫，付 义，伍宏泽，刘永芳

1江西省中医肾病临床医学研究中心九江市中医院，九江 332000；2湖南中医药大学；3湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室；4湖南中医药大学中医心肺病证辨证与药膳食疗湖南省重点研究室，长沙 410208

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是一种自身免疫性疾病，以免疫复合物IgA沉积在肾小球系膜区为特征，常伴内皮增生和足细胞损伤。在我国发病率高，约占原发性肾小球肾损害的32%～54%，约40%患者将在病程20年左右进入终末期肾病[1,2]。目前治疗主要是控制血压、降尿蛋白、激素及免疫抑制剂等，虽然可延缓疾病进展，但相关药物不良反应也限制了疗效[3]。因此，积极探索IgAN的理想治疗药物，保护肾脏功能，已成为亟待解决的临床问题。

中医药治疗IgAN历史悠久，可提高疗效、保护肾功能[4]，但目前的研究角度尚单一，未能系统论证中医药治疗IgAN的机制。陈帮明教授为江西省中医肾病临床医学研究中心学科带头人，省级名中医，集采众家之长，认为正虚伏邪扰肾为本病病机[5]。针对正虚，擅用黄芪-冬虫夏草药对补益肺脾肾。黄芪甘温，培补肾气、健脾消肿，具有调节免疫、降低尿蛋白、保护肾功能等作用，可通过上调肝细胞生长因子(HGF)和下调转化生长因子-β1(TGF-β1)而抑制肾纤维化，提高IgAN外周血B淋巴细胞和降低糖基化水平[6,7]。冬虫夏草味甘性平，补益肺肾，可抑制VEGF及IgA系膜细胞增生，修复肾脏损伤[8,9]；现代研究证实两药均有调节免疫、抑制系膜增生的功效，联用可协同增效。故本文基于网络方法的药物作用机制发现策略，旨在从系统角度和分子水平发现研究付义主任黄芪-冬虫夏草药对的作用机制，与中医学整体观念和辨证论治原则具有异曲同工之妙，因此，运用网络药理学技术可预测黄芪-冬虫夏草药对治疗IgAN的多成分-多靶点-多疾病的整合机制，同时为将来的实验验证提供方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄芪-虫草药对由黄芪20g、冬虫夏草10g组成，中药饮片均购于江西中医药大学附属九江市中医院中药房。本院制剂室根据人临床等效剂量水煎浓缩为0.72 g/mL，置于无菌棕色瓶，4 ℃冰箱保存备用。牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma-Aldrich公司，批号：20200823)；脂多糖(LPS，美国Sigma-Aldrich公司，批号：20200815)；四氯化碳(CCl4，上海阿拉丁生化科技股份供销公司，批号：20200705)；VEGFA(上海泛柯实业有限公司，批号20211205)。

选取SPF级雄性SD大鼠30只进行药物血清制备，体质量180～220g，购于湖北省实验动物研究中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2020-0014。饲养于九江学院附属医院动物房，温度21～25℃，相对湿度40%～70%，每日定时喂养，实验动物伦理批号：LL20220304011。

1.2 黄芪-冬虫夏草主要化学成分收集及筛选

应用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.IgAN/tcmsp.php)及BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索所有活性成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为限制条件进行筛选，得到黄芪-冬虫夏草生物活性成分。另外对未入选数据库，但文献报道有生物活性的化学成分也纳入候选，建立药物-化学成分数据集。

1.3 成分潜在靶点收集

应用TCMSP及BATMAN-TCM数据库检索黄芪-冬虫夏草活性成分的靶基因，通过Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)构建活性成分-靶点互作网络。

1.4 IgAN疾病靶点筛选

设置检索词为“IgAN”，通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)及OMIM数据库(https://www.omim.org/)进行检索，筛选得到IgAN疾病靶点，并应用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)筛选出人源靶点并进行标准化，获得Swiss-Prot ID。

1.5 黄芪-冬虫夏草活性成分与IgAN的共同靶点筛选及PPI网络构建

明确IgAN相关靶点与黄芪-冬虫夏草潜在靶点之间的相互作用，应用R语言(https://www.r-project.org/)软件及Perl语言程序将疾病靶点与药物靶点进行交集。应用STRING(https://string-db.org/)插件构建共同靶点互作网络(protein-protein interaction，PPI)。应用count.R插件获得共同蛋白靶点出现的频次。

1.6 活性成分-IgAN-靶点互作网络构建

应用Cytoscape 3.7.2软件中merge功能构建活性成分-IgAN-靶点互作网络。网络图中“node”代表活性成分和靶点，“edge”代表活性成分-IgAN-靶点之间的相互关系。查阅文献，基于构建的网络探讨黄芪-冬虫夏草治疗IgAN的潜在机制。

1.7 GO生物功能分析和KEGG通路富集

应用R语言中Cluster Profiler GO.R插件及Perl语言对活性成分与IgAN共同靶点进行GO分析。应用Cluster Profiler KEGG.R插件进行KEGG通路分析。根据富集因子值分析核心通路富集程度，探究黄芪-冬虫夏草治疗IgAN的可能的生物功能及信号通路机制。

1.8 分子对接

采用AutoDock vina软件对PPI网络中度值最高的VEGFA与黄芪-冬虫夏草5个主要成分进行分子对接。从RCSB PDB蛋白质结构数据库和PubChem数据库中分别获得靶点蛋白的三维结构和主要成分的化学结构，采用AutoDock Tools对上述蛋白受体和配体进行常规处理，再用其插件Autogrid得到对接活性位点，进行分子对接，得到结合能(affinity)。

1.9 分组及给药

实验大鼠随机分为空白组和模型组，模型组大鼠按改良的联合免疫诱导法BSA+LPS+CCl4建立模型。具体方法：BSA，加蒸馏水配制成100 g/L浓度，按600 mg/kg隔日灌胃1次，持续12周；CCl4+蓖麻油，每只0.1 mL+0.3 mL，每周首日颈部皮下注射1次，持续12周；LPS按0.05 mg/只的量，于第6周和第8周首日尾静脉各注射1次。空白组则采用同一时间、等体积的蒸馏水灌胃，蓖麻油(0.5 mL)皮下注射以及尾静脉注射[10]。12周后，模型组大鼠肾脏病理免疫荧光提示肾小球IgA沉积[10]。造模成功大鼠随机分为模型组和黄芪-冬虫夏草药对组，空白组、模型组按10 mL/kg给予蒸馏水灌胃；药对组黄芪和虫草配伍后用含0.1%羧甲基纤维素钠的蒸馏水配制成生药量为1.27 g/mL的溶液备用(根据黄芪与虫草(2∶1)的剂量(黄芪20 g，虫草10g)，换算为动物给药剂量配置)。每日1次，持续21日。

1.10 标本检测

给药第21天后分别收集大鼠24 h尿液，记录尿量，并送医院检验科检测尿蛋白含量。治疗结束后次日，安乐死大鼠，迅速暴露并分离出肾脏(在冰台上操作)，从肾门处剪下肾脏并快速剥离肾包膜，组织匀浆。送医院检验科，采用酶联免疫法按说明书测定肾组织VEGFA含量。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 黄芪-冬虫夏草药物有效成分挖掘

利用TCMSP数据库对黄芪-冬虫夏草药对现有的成分进行挖掘，限定OB≥30%和DL≥0.18进行选取，去除重复成分后获得27个有效成分(见表1)。

表1 黄芪-虫草药对活性成分

2.2 黄芪-冬虫夏草的活性成分的收集和筛选

获得27个生物活性成分，其作用靶点共109个(不含重复)，其中排名靠前的主要成分有花生四烯酸、β-谷甾醇、槲皮素。对应成分与作用靶点，发现单个活性成分可作用多个靶点，多个活性成分也可共同作用单个靶点，证实黄芪-冬虫夏草是以多靶点、多途径来发挥整体作用。

2.3 IgAN的靶点筛选

利用GeneCards、OMIM数据库挖掘得到IgAN的疾病治疗靶点，设置Relevance score≥3.6并删去重复靶点，共得到604个IgAN的疾病治疗靶点。

2.4 共同靶点筛选及互作网络构建

将604个IgAN治疗靶点与药物活性成分作用靶点应用R语言软件及Perl语言程序筛选出共同靶点共37个；应用STRING数据平台输入37个共同靶点，在“high confidence：0.9”的模式下构建互作网络(PPI)(见图1)。应用count.R插件统计出现频次前10的蛋白靶点，出现频次较高的有VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3等(见表2)，可作为黄芪-冬虫夏草治疗IgAN的潜在靶点。

图1 共同靶点互作网络(PPI)Fig.1 Common target interaction network (PPI)

表2 常见蛋白质靶点频率

2.5 生物分子网络构建

采用Cytoscape 3.7.2软件在活性成分-靶点互作网络图中，共获得42个节点(靶点37个，活性成分5个)(见图2)。其中三角形代表黄芪-冬虫夏草活性成分，椭圆形代表黄芪-冬虫夏草活性成分与IgAN的共同靶点。

2.6 黄芪-冬虫夏草治疗IgAN的生物功能(GO)分析及核心通路筛选

并利用R语言软件对以上共同靶点进行GO功能分析得到的柱状图(见图3)，其中的生物过程主要涉及类固醇结合、细胞凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性、雌激素受体结合、胆固醇结合等。这体现了黄芪-冬虫夏草可能通过调控多个复杂的生物过程来治疗IgAN。图4显示了黄芪-冬虫夏草作用靶点的KEGG通路富集分析结果。通过分析，37个共同靶点主要分布脂质与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt信号通路等多条信号通路中，这些表明黄芪-冬虫夏草通过作用于多条信号通路来协调治疗IgAN。

图2 活性成分-靶点互作网络Fig.2 Interaction network of compounds-targets

图3 GO功能分析直方图Fig.3 Histogram of GO analysis

图4 KEGG富集分析图Fig.4 Results of KEGG pathway analysis

2.7 分子对接

采用AutoDock vina软件将主要成分与关键靶点VEGFA进行分子对接后，得到结合能数值分别为β-谷甾醇-26.6 kJ/mol、异鼠李素-22.02 kJ/mol、山奈酚-19.34 kJ/mol、槲皮素-18.21 kJ/mol、花生四烯酸-12.89 kJ/mol，结合能越小对接越好。表中主要成分都能与靶点蛋白较好地结合。其中β-谷甾醇与VEGFA结合性最好(见图5)。结果表明，这5种主要成分与蛋白靶点相互作用，结合后呈现稳定状态。

图5 β-谷甾醇与VEGFA的分子对接图Fig.5 Molecular docking diagram of β-sitosterol and VEGFA

2.8 黄芪-冬虫夏草对IgAN大鼠对尿蛋白影响

模型组尿蛋白较空白组显著增加(P<0.05)，黄芪-冬虫夏草组尿蛋白较模型组显著降低(P<0.05)，结果见表3。

表3 尿蛋白定量

2.9 黄芪-冬虫夏草对肾组织VEGFA含量的影响

与正常组比较，模型组VEGFA含量显著升高(P<0.05)，给予黄芪-冬虫夏草治疗后，VEGFA含量较模型组显著下降(P<0.05)，结果见表4。

表4 对肾组织VEGFA含量影响

3 讨论与结论

依据其临床特征，本病归属中医学尿血、尿浊、慢肾风等范畴。中医学认为本病多为脾肾亏虚为本，湿浊内蕴，日久成瘀为标；根据对文献挖掘证据表明，中药治疗IgAN以补益肺脾肾为主，活血化瘀贯穿始终[11]。陈帮明主任认为IgAN免疫复合物沉积属中医“微干血”，“瘀、浊”为其核心病机，黄芪-冬虫夏草药对不仅可补益肺脾肾，且可抑制肾纤维化、祛除肾中顽瘀，延缓肾功能进展[5,12]。

本研究筛选出37个生物活性成分，从活性成分-靶点互作网络构建结果中得知其关键活性成分是花生四烯酸、β-谷甾醇、异鼠李素、山奈酚、槲皮素。花生四烯酸是一种n-6必需脂肪酸，可调节人体免疫功能、抗血小板聚集、抗凝、抑制肾纤维化、保护足细胞[13,14]；β-谷甾醇通过提高抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(CAT)等，具有显著抗氧化作用，且可以降低肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6水平，抑制TLR受体信号转导发挥抑炎作用[15]。异鼠李素通过作用TGF-β1/Smad3和TGF-β1/p38 MAPK通路抑制细胞外基质形成而抑制纤维化[16]。山奈酚可通过抑制ASK1/MAPK通路，显著降低氧化应激和脂质过氧化[17]；通过NF-κB信号通路抑制炎症因子释放[18]。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抑炎、降低代谢毒素、保护肾脏的作用[19]。综上，黄芪-冬虫夏草主要活性成分可能通过抗纤维化、抗氧化、调节免疫、抑制炎症等从而发挥治疗IgAN作用。

基于黄芪-冬虫夏草活性成分-IgAN-靶点互作网络，发现了VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3等关键靶点。研究表明，VEGFA是VEGF的亚型，可促进间质纤维化，在IgAN患者肾小球和肾小管上皮细胞中高表达，可破坏肾脏屏障，加重蛋白尿，可独立预测IgAN患者临床结局[20]。免疫复合物沉积系膜区，刺激内皮细胞分泌大量VEGF，与受体结合后诱导血管新生，同时通过刺激氧化应激、炎症，进一步加重系膜增生，胞外基质增多，导致肾小球硬化[21]。HIF1A可以通过在转录和转录后激活Notch-1，从而促进肾纤维化[22]。NOS3可减少SOD水平，发挥抗氧化、抑炎作用[23]。Caspase-3是细胞凋亡过程中主要效应因子，介导肾脏炎症反应、纤维化形成的相关凋亡[24]。

结合KEGG数据库对信号通路注释分析发现，黄芪-冬虫夏草的生物有效成分可能通过作用于脂质与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt信号通路等。脂质与动脉粥样硬化是肾脏疾病合并心血管风险的主要因素[25]。流体剪切应力与动脉粥样硬化通路是抑制炎症、血管舒张、抗动脉粥样硬化的主要途径[26]。AGE/RAGE可促进炎性细胞因子释放和细胞外基质生成，导致肾小球肥大和肾小球硬化，亦可与胶原蛋白发生交联，而介导蛋白质沉积[27]。PI3K-Akt信号通路可介导肾脏炎症和细胞凋亡[28]。

综上，本研究显示黄芪-冬虫夏草通过作用于VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3关键靶点及脂质与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、PI3K-Akt信号通路等多条信号通路而抑制纤维化、抗炎、氧化应激等多个病理环节，从而发挥多环节、多靶点的整合调节效应。分子对接也确证上述成分和靶点之间有较强的结合活性。同时结合了IgA大鼠模型对有强烈结合活性VEGFA靶点进行验证，结果表明黄芪-冬虫夏草药对可以显著降低模型组大鼠尿蛋白、VEGFA含量，证实黄芪-冬虫夏草可通过多分子靶点、多途径而延缓IgA肾病进程。