李 震，易 瑶，何旭江，黄 强，刘一博，曾志将*

（1.江西农业大学 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室，江西 南昌 330045；3.江西中医药大学，江西 南昌 330004）

【研究意义】蜜蜂蜂王是蜂群的核心，蜂王质量优劣不仅直接关系到蜂群群势强弱以及蜂产品产量高低[1-2]。蜜蜂的授粉行为对全球农业生产都具有极其重要的促进作用[3-4]。但2006 年美国暴发的蜂群衰竭失调病（Colony Collapse Disorder，CCD）引发了北美授粉危机，具体表现为蜂群内大量工蜂突然失踪，只留有蜂王、大量幼虫和少量工蜂[5]。研究表明，CCD 的暴发与蜂王质量密切相关[6]。幼虫日龄、食物来源、生活空间、DNA 甲基化和母体效应等因素均参与了蜂王的发育调节[7-10]。尽管关于DNA 甲基化调节蜂王发育已有诸多报道[9,11-12]，但DNA 甲基化在蜜蜂群体内的遗传规律尚不清晰。而深入解析西方蜜蜂DNA 甲基化遗传调控机制，能够为优育蜂王提供理论指导，同时也为解决CCD 问题提供新思路。【前人研究进展】Kucharski 等[10]发现，蜂王食物中的营养物质通过介导DNA 甲基化来调节蜜蜂级型分化，这首次在分子水平上揭示了DNA 甲基化对蜜蜂表观遗传现象。此外，Shi 等[8]报道王台大小也会影响蜜蜂的DNA 甲基化，进而调节蜜蜂的级型分化。本研究组前期发现：随着移植蜂王幼虫日龄的增加，所培育出蜂王的出生重、胸部长度和宽度均逐渐减小；与低日龄蜂王幼虫培育出的蜂王相比，由3 日龄的幼虫培育出的蜂王的整体DNA 甲基化水平最高[13]。同时，蜂王的差异性DNA 甲基化区域（Differential DNA Methylated Regions，DMRS）在连续几代中有累积效应[14]。蜜蜂DNA 甲基化可通过父系遗传印迹[15]。DNA 甲基化是表观遗传信息稳定跨带传递的媒介，也是最早开始研究的表观遗传遗传信息载体[16-17]。【本研究切入点】目前还不清楚蜜蜂DNA 甲基化是否与斑马鱼（Brachydanio rerio）、果蝇（Drosophilid）、长牡蛎（Crassostrea gigas）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等模式生物一样具有母系表观遗传印迹特性[18-21]，也不清楚环境（移虫日龄）对蜜蜂DNA 甲基化表观遗传印迹的影响[22]。【拟解决的关键问题】本研究利用蜂王单雄授精技术成功培育出1 只单雄授精产卵蜂王G0，并人工建立了1 个具有3 种蜂王后代的品系（分别利用3 日龄卵、1 日龄幼虫和2 日龄幼虫所培育出的G1 蜂王）。待G1 代蜂王交尾产卵后，拟采集G0 代蜂王、G1 代蜂王和G1 代蜂王产的雄蜂进行全基因组DNA 甲基化测序来系统探究西方蜜蜂DNA 甲基化表观遗传印迹特性，以及移虫日龄对西方蜜蜂DNA 甲基化表观遗传印迹影响，以期探明DNA 甲基化调控西方蜜蜂蜂王发育的分子机理，进一步揭示移虫日龄调控蜂王及后代雄蜂发育的内在机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验蜂群：江西农业大学蜜蜂研究所饲养的西方蜜蜂（A.mellifera），试验时间：2018 年3—10 月，按标准方法进行饲养。试验试剂：OMEGA组织DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 蜜蜂取样方法 将1只单雄人工授精并成功产卵的蜂王（G0），限制在免移虫塑料巢脾上产卵6 h。对G0 代蜂王进行单雄授精，G0 代蜂王产卵后，以卵（E）、1 日龄工蜂幼虫（L1）和2 日龄幼虫（L2）分别培育蜂王（G1代，以卵培育的蜂王简称G1E，以1日龄幼虫培育的蜂王简称G1L1，以2日龄幼虫培育的蜂王简称G1L2），然后以G1 代蜂王产卵培育雄蜂（G2 代，G1E 产的雄蜂简称G2DE，G1L1 产的雄蜂简称G2DL1，G1L2产的雄蜂简称G2DL2）。采样方法见图1。

图1 样品采集Fig.1 Samples collection

1.2.2 全基因DNA 甲基化测定方法 取G0、G1E、G1L1、G1L2 蜂王以及G2DE、G2DL1、G2DL2 雄蜂，将其头、胸组织提取DNA 后送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组甲基化测序。上机测序后得到的原始数据均已上传NCBI，提交序列号为SUB9847854，数据序列号为PRJNA737625。将原始数据删除低质量数据和测序接头来得到高质量的clean data。以西方蜜蜂基因组（Amel_HAv3.1 版本）为参考序列，采用Bismark 软件将甲基化数据与参考基因组进行比对分析[23]。首先去除甲基化数据中的重复部分；然后以比对上的参考基因组的C 位点的碱基类型：若比对上的碱基为C，则判定该位点发生了甲基化；若为T，则未发生甲基化。甲基化水平的计算公式为：

式（1）中：ML为甲基化水平；mC为甲基化C的数量；umC未甲基化C的数量。

1.2.3 原有高甲基化位点和突变高甲基化位点统计 参照Liu等[24]的方法，选取ML≥0.8的位点为高甲基化位点。原有高甲基化位点指的是高甲基化位点从G0传递到G1、G2时共有的个数；突变高甲基化位点的研究对象是G0代蜂王的低甲基化位点遗传到G1代蜂王和G2代雄蜂时变为高甲基化位点。

1.3 数据分析与统计

利用SPSS25.0进行分析雄蜂甲基化的数据。数值用平均值±标准误（Mean±SE）表示，并通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和Fisher's LSD检验进行分析。P＜0.05表示数据差异显著。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA整体甲基化测序质量

18 个样品的平均clean reads 数为3 820 492，平均clean base 为9.90 G，Q20 的平均为96.70%，Q30 的平均值为91.69%，亚硫酸氢盐的平均转化率为99.70%（表1）。

表1 甲基化测序结果统计Tab.1 Statistics quality of DNA methylation sequencing

2.2 DNA甲基化遗传表观印迹特性

2.2.1 原有高甲基化位点遗传印迹 从图2 可见：以卵和1 日龄幼虫培育的G1 代蜂王（G1E、G1L1），分别从G0代蜂王中遗传了57.6%和57.4%的高甲基化位点，远低于以2日龄幼虫培育的G1代蜂王（G1L2）遗传的79.5%高甲基化位点。同样，G1E 和G1L1 所产的雄蜂（G2DE，G2DL1）分别遗传了来自G0 的36.5%和39.2%高甲基化位点，也远低于G2DL2从G0遗传的51.3%高甲基化位点。

图2 原有DNA高基化位点遗传印迹Fig.2 Intergenerational marks of original high-methylation loci

2.2.2 突变高甲基化位点遗传印迹 从图3可见：G1代蜂王（G1E，G1L1，G1L2）从G0代蜂王遗传的突变高甲基化位点随着移虫日龄的增加而增加；G2DE、G2DL1和G2DL2从各自母本蜂王（G1E、G1L1和G1L2）中遗传了40.1%、38.7%和35.4%的高甲基位点。虽然遗传的高甲基化位点比例随着移虫日龄增加而减少，但G2代雄蜂（G2DE，G2DL1，G2DL2）从G1代蜂王遗传的高甲基化位点随着移虫日龄的增加而增加。

图3 突变高基化位点遗传印迹Fig.3 Intergenerational marks of mutational high-methylation loci

2.3 移虫日龄对DNA甲基化遗传表观印迹影响

2.3.1 移虫日龄对原有高甲基化位点遗传的影响 从图4 可见：G2DL2 从G0 代蜂王遗传到的原有高甲基化位点显著高于G2DE和G2DL1从G0代蜂王遗传到的原有高甲基化位点（P＜0.05）。

图4 移虫日龄对原有高甲基化位点遗传的影响Fig.4 The effect of the age of immigrants on the inheritance of the original high-methylation loci

2.3.2 移虫日龄对突变高甲基化位点遗传的影响 从图5可见：随着移虫日龄的增加，从G0代蜂王遗传印迹到G2 代雄蜂的突变高甲基化位点数目随之增加。且G2DL2 遗传到的突变高甲基化位点显著高于G2DE和G2DL1（P＜0.05）。

图5 移虫日龄对突变高甲基化位点遗传的影响Fig.5 The effect of the age of immigrants on the inheritance of the mutational high-methylation loci

2.4 高甲基化位点遗传印迹模式图

研究结果揭示了3个调控蜜蜂级型分化的关键基因高甲基化位点遗传印迹模式（图6）。LOC409393基因高甲基化位点遗传印迹模式图揭示了一些原有高甲基化位点能够从G0 代蜂王稳定遗传印迹到G2代雄蜂（图6A）。LOC409393 和LOC408438 高甲基化位点遗传印迹模式图则进一步证明了随着移虫日龄增加，所培育G1 代蜂王从G0 代蜂王获得的高甲基化位点数目增多，且G2 代雄蜂从G1 代蜂王处获得的高甲基化位点数目同样增多（图6A，图6B和图6C）。

图6 3个基因的高甲基化位点遗传印迹模式Fig.6 Intergenerational marks patterns of methylation sites with 3 genes

3 讨论与结论

DNA 甲基化普遍存在于动植物和真菌等基因组中，是目前研究最广泛的表观修饰机制。大量研究表明：DNA 甲基化调控蜜蜂级型分化过程，进而影响蜂王发育质量[11-15]，但仍然有许多研究问题还不清楚，比如蜜蜂DNA甲基化与蜂王质量关系；蜜蜂DNA甲基化能否母系表观遗传印迹。

Shi 等[11]发现工蜂DNA 甲基化水平是随着幼虫日龄增高，而蜂王DNA 甲基化水平是先升高然后下降。Yi 等[14]首次发现在逐代培育蜂王过程中，DNA 甲基化存在累代现象。本研究首次发现原有高甲基化位点和突变甲基化位点都存在表观遗传印迹现象，有助于解释蜂王与工蜂DNA 甲基化水平差异及累代现象。而Yi等[13]发现移虫日龄的增加，所培育的蜂王初生重、胸长和胸宽等指标逐步下降，而3日龄蜂王整体DNA 甲基化水平却逐步提高；Yi 等[25]进一步研究发现：蜂王质量随着移虫日龄的增加而降低，同时随着移虫日龄的增加，移虫培育的蜂王与移卵培育的蜂王之间的差异甲基化基因数量逐步增多，差异甲基化基因涉及蜜蜂级型分化、寿命、免疫、发育等重要途径。本试验首次发现：现随着移虫日龄增加，原有高甲基化位点和突变高甲基化位点遗传印迹数量都是逐步增加。

DNA 甲基化位于启动子区时抑制基因的表达，但当甲基化位于基因区时，它不仅不抑制基因的表达，相反还会起到促进作用[26]。有研究表明：基因区甲基化程度小于70%时正向调控基因表达，大于70%时会起负调控作用[27]。本试验选取外显子上甲基化程度大于和等于80%的位点作为高甲基化位点，因此基因区高甲基化位点数目越多，其自身表达将会进一步受到抑制。LOC408438和LOC409393基因被干扰或剪切时，蜂王幼虫会在实验室培育条件下转向完整工蜂形态发育，并出现卵巢管数减少这一生殖退化现象[28-29]。而LOC408438 和LOC409393 基因的高甲基化位点遗传印迹模式图揭示了在使用2 日龄以上（包括2 日龄）的幼虫人工培育蜂王时，会造成蜂王和后代雄蜂获得的更多的高甲基化位点，这或许会导致培育的蜂王出现质量下降现象[14]，进而降低整个蜂群繁衍。

因此，在当前西方蜜蜂大规模商业饲养的大背景下，建议养蜂者应优先利用卵和1 日龄小幼虫来培育优质蜂王，提高蜂群的繁殖和存续能力，达到预防发生CCD 的目的，本研究结果进一步解释了蜜蜂DNA甲基化与蜂王质量关系，为在养蜂生产中人工培育优质蜂王和CCD防控提供了全新思路。