刘雪莲 程文博 朱俊义

(通化师范学院，通化，134002)

侧金盏花(AdonisamurensisRegel et Radde)为毛茛科多年生草本植物，又名冰凉花、福寿草、顶冰花等，分布于东北地区山坡或山脚的灌木丛间、阔叶林下以及林缘地上[1]。侧金盏花能在雪融之时迅速开花、展叶并结实，林冠层郁闭时地上植株迅速枯萎死亡，而地下部分随即进入休眠，属于典型的早春类短命植物类型[2]。虽然侧金盏花生育期极短仅40～60 d左右，但花期相对较长，可达20 d以上，且花大，色彩艳丽，花期可填补早春时节的空白，具有很好的观赏价值，是春季园林美化的理想材料。因此，很多学者就侧金盏花的生物学特性[3-8]、繁殖特性[9-12]、分子生物学[13-15]以及药学[16-18]等方面开展了大量研究，梁宇等[19]研究了侧金盏花花芽分化与地温的关系，而关于侧金盏花花芽分化形态特征、进程及相关生理生化变化目前相关报道极少。本试验通过对侧金盏花地下芽不同时间取样，解剖观察花芽分化形态，测定芽和根中相关代谢物质含量和酶活性的变化，揭示侧金盏花地下芽花芽分化过程及生理基础，对了解花芽分化过程生理生化变化及制定栽培管理措施具有重要意义。

1 研究区概况

试验用侧金盏花生长于长白山脉通化段天然林下(125°55′45″～125°55′59″E，41°37′55″～41°37′59″N，海拔700～750 m)，2019年5月中下旬地上植株枯萎后将地下根茎移植于通化师范学院实践栽培基地(125°58′49.63″E，41°44′47.04″N，海拔429 m)。该区位于吉林省东南部长白山脉通化段老岭山脉和龙岗山脉之间，属于北温带大陆性季风气候，冬季严寒而干燥，低温时间长达5个月，夏季炎热且高温时间短促，年平均气温5.8 ℃，平均无霜期155 d，年降水量893～1 083.8 mm，主要集中在7—8月[20]。

2 材料与方法

从5月19日移植开始，每隔3 d取样1次，将根茎上生长一致的小芽取下，用FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(甲醛)∶V(冰乙酸)=90∶5∶5)固定48 h以上，通过石蜡切片和扫描电子显微镜(SEM)观察确定花芽分化时期。

石蜡切片方法：取出经FAA固定液固定的芽体，进行芽整体染色(70%、50%乙醇各4～6 h后转入爱氏苏木精稀释液整染4 d)；水洗返蓝；然后进行乙醇梯度脱水；1%伊红溶液复染，无水乙醇脱水；氯仿逐级透明、石蜡渗透与包埋；Leica切片机切片，Olympus数码生物显微镜(BX-51)观察摄影[21]。

扫描电子显微镜(SEM)观察的材料样本的处理过程包括：取出经FAA固定液固定的芽体，体视显微镜(ZEISS Stemi 508)下剥去芽鳞，暴露需要观察的部分，将材料用乙醇、丙酮、乙酸异戊酯梯度脱水，CO2临界点干燥(Hitachi HCP-2)，粘台，真空喷金镀膜(KYKY SBC-2)，在HITACHI S-3000N型扫描电子显微镜下观察与照相[22]。

芽及根中相关代谢产物质量分数及酶活性的测定：根据解剖观察的花芽分化进程，将每一分化阶段的芽和根用液氮速冻、超低温冰箱-80 ℃保存，用于酶活和可溶性蛋白质量分数的测定，另取一部分于80 ℃烘干用于营养代谢产物质量分数的测定。淀粉质量分数、可溶性总糖质量分数采用蒽酮比色法；可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250染色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[23]。

数据处理：采用Excel2013、Statistics V 25.0软件对数据进行误差分析。

3 结果与分析

3.1 侧金盏花花芽分化的形态进程

经解剖、扫描电子显微镜观察和石蜡切片观察发现，侧金盏花花芽分化可划分为未分化期、花芽分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6个时期，整个分化过程约经历60 d左右，其分化进程及形态特点如图1、图2所示。

未分化期：侧金盏花盛花期时根茎处便萌生地下芽，直到地上部枯萎一直进行营养生长。5月中旬解剖观察发现，地下芽茎尖分生组织扁平，宽度大于高度，体积小，周边螺旋式分化出多个芽鳞原基，尚未进行花芽分化(图1：1；图2：1)。

花芽分化始期：5月下旬，侧金盏花的大部分地下芽由营养生长转变为生殖生长，茎尖分生组织体积增大，逐渐向上隆起成球形，高度与宽度相当，可见花原基形成(图1：2；图2：2)。

萼片分化期：6月上旬，在花原基形成后，其基部分化出半月形的凸起，为萼片原基，基部较宽、先端平截，顺时针向心式分化，萼片分化时间较短，大约8 d左右萼片原基分化完成，可见8～9枚萼片原基呈两轮排列于花原基的基部(图1：3；图2：3～5)。

花瓣分化期：6月中旬，花瓣原基顺着萼片原基的序列开始向心式分化，外形与萼片原基相似，共12～13枚，分3轮排列。约10～12 d分化完毕(图1：4～7；图2：6～7)

雄蕊分化期：6月下旬至7月上旬，花被原基形成后，在其内侧基部顺时针向心方向顺次形成突起，该突起组织内细胞经快速分裂、分化形成雄蕊原基，雄蕊原基半球形，与花瓣原基非常相似，共3～4轮(图1：8～9；图2：8)。

雌蕊分化期：雄蕊原基全部发生后，花托向上隆起，顶端变得平坦，雌蕊原基仍以顺时针螺旋状向心发生将整个花托充满，无剩余空隙(图1：10～12；图2：9)，全部雌蕊原基分化完成约需10 d左右。

3.2 侧金盏花花芽分化过程中营养物质质量分数的变化

淀粉作为侧金盏花根部的主要贮藏物质，在生殖生长时会被大量消耗来维持正常的生理代谢活动。从表1可以看出，根中淀粉质量分数随花芽分化的进程呈快速下降趋势，芽中淀粉质量分数呈先升高后下降的趋势。在未分化期淀粉质量分数最大达96.29 mg·g-1，花芽分化始期开始明显下降，在萼片分化期下降幅度最大，此时根中淀粉质量分数为28.35 mg·g-1，与未分化期相比，下降了70.56%。而后花器官各部分分化期时，根中淀粉质量分数差异不显著。芽中淀粉质量分数在未分化期时质量分数较低，而在花芽分化始期质量分数陡然升高，随后在萼片分化期又显著降低(P<0.05)，而在后面的几个分化阶段质量分数趋于稳定，这说明花芽分化消耗了根中大量的淀粉。

1.花芽未分化期，生长点分化出芽鳞；2.分化始期，花原基形成；3.萼片分化期，萼片原基以顺时针向心式发生，两轮；4～6.花瓣分化期，花瓣原基沿萼片的序列螺旋发生，3轮排列；7.花瓣原基发生后正面观；8.雄蕊分化期，雄蕊原基发生；9.雄蕊原基发生正面观，雄蕊原基3-4轮；10～12.雌蕊分化期，雌蕊原基发生，花托顶端平坦。BS.芽鳞;FP.花原基;Se.萼片;Pe.花瓣;St.雄蕊;Pi.雌蕊。比例尺:2=100 μm;3～5,7=200 μm;1,6,8～10,12=300 μm;11=500 μm。

表1 侧金盏花花芽分化进程中根、芽营养物质质量分数和酶活性变化

可溶性糖由淀粉降解产生，是侧金盏花花芽分化过程中可直接运输与利用的养分形式。由表1可以看出，芽中可溶性糖质量分数在花芽分化始期陡然升高，而后逐渐下降。而根中可溶性糖质量分数变化呈先下降后上升的趋势，在雌蕊分化期显著升高(P<0.05)，各阶段根中可溶性总糖质量分数均低于芽中的质量分数，说明侧金盏花花芽分化需要消耗大量的糖类，根中大量的可溶性糖转移到芽中用于完成花芽分化。

蛋白质是细胞分裂和分化的主要物质基础，其质量分数变化与成花有密切关系。从表1可看出，芽和根中的可溶性蛋白质量分数在侧金盏花花芽分化进程中变化趋势较为一致，均在花芽未分化期处于一个较低的水平，随着花芽分化的启动，蛋白质的质量分数显著提高，在花瓣分化期达到峰值，在雄蕊分化期时大幅度下降，而在雌蕊分化期又快速回升。

3.3 侧金盏花花芽分化过程中抗氧化酶活性变化

如表1所示，侧金盏花花芽分化期芽中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后下降趋势，在萼片分化期活性最强，为1 443.35 U·g-1·h-1，与未分化期活性相比提高了67.15%。萼片分化期后开始逐渐下降，到雌蕊分化期时芽中SOD活性为1 134.46 U·g-1·h-1，与未分化期活性相比仍提高了31.38%。根中SOD活性变化整体呈先升高后下降再升高的趋势，雌蕊分化期活性最高为1 220.60 U·g-1·h-1，比未分化期活性提高了61.71%。除雌蕊分化期外，其他各时期芽中SOD活性均高于根中SOD活性。

芽中过氧化物酶(POD)活性在花芽分化期间呈先升高后降低再升高的趋势变化，在萼片分化期时活性最高为3 730.83 U·g-1·min-1，随后快速下降，虽在雌蕊分化期有提高，但花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期3个时期差异不显著，与未分化期相比差异显著(P<0.05)。根中POD活性呈波动变化，以花瓣分化期活性最低，雄蕊分化期活性最高。芽中POD活性在分化始期开始各时期均明显高于根中。

侧金盏花芽中过氧化氢酶(CAT)活性在花芽分化期间呈先升高后下降趋势，前期活性提高缓慢，雄蕊分化期以前，各阶段活性增加幅度较小，差异不显著，而在雄蕊分化期活性陡然提高，达4 752.88 U·g-1·min-1，与未分化期相比提高了108.30%。根中CAT活性的变化趋势与芽中的活性变化趋势相近，雄蕊分化期前的各分化阶段活性变化不大，活性基于平稳，而在雄蕊分化期活性显著增加，随后又少量下降。说明CAT参与侧金盏花花芽分化的调控，尤其对雄蕊和雌蕊原基的调控作用更强。

4 讨论

4.1 侧金盏花花芽分化形态发育特点

花芽分化是复杂的形态分化和生理生化过程，明确花芽分化的日期，了解侧金盏花花芽分化的全过程及相关代谢产物含量及酶活性的变化，不仅可为掌握侧金盏花生物学特性提供基础资料，也为侧金盏花引种栽培及管理提供理论依据。本研究采用石蜡切片方法和扫描电子显微镜观察，明确了侧金盏花花芽分化进程及形态特点。侧金盏花为早春类短命植物，5月中下旬地上部分枯萎死亡后，地下芽不进行休眠，而是直接进行花芽的形态分化，到7月中旬分化结束，大约需60 d左右。根据侧金盏花花芽的形态结构变化将花芽分化划分为花芽未分化期、分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6个时期。花芽分化完成后进一步发育至土壤上冻形成花蕾进行越冬休眠。因此，侧金盏花不存在夏季休眠，而是进行着非常活跃的生理生化活动，完成了生活史中的全部形态建成。这一结果与万清林[24]认为侧金盏花在春末夏初地上部分枯萎死亡后，地下贮藏器官要进行夏季休眠以躲避高温，而在秋季恢复地下的缓慢生长，形成充分分化的混合芽进入冬季休眠不同。

4.2 营养物质代谢对侧金盏花花芽分化的影响

碳水化合物是重要的营养物质之一，作为机体代谢的主要能源、结构物质以及参与花发生调节因子的重要组分，它与植物的成花过程密切相关[25-26]。张诗艳等[27]研究表明海南蒲桃花芽形态分化初期和雄蕊雌蕊形成期，花芽可溶性糖和淀粉质量分数较高。汪晓谦等[28]研究发现郁金香在进入花芽形态分化期后，鳞茎可溶性总糖质量分数明显升高。欧阳芬等[29]认为锥栗完全混合花芽、不完全混合花芽及叶芽中可溶性糖质量分数的变化趋势相似，峰值均出现在冬后花序原基分化期；李志娟等[30]研究表明，萱草茎尖可溶性糖质量分数在花序原基形成期瞬时升高。根中淀粉质量分数在芽生理分化期出现高峰，在花序原基分化期根内淀粉显著下降，至花原基分化期质量分数最低。本试验研究结果表明，侧金盏花花芽分化过程中，地下芽和根中活跃的生理代谢为花芽分化和发育提供了营养保障。侧金盏花在花芽未分化期根中淀粉大量积累达到峰值，在分化始期，根中淀粉和可溶性总糖质量分数有所下降，而芽中淀粉质量分数和可溶性总糖质量分数积累达到峰值，且芽中可溶性总糖质量分数远远高于根中；此后随着花芽分化进程的推进，根中和芽中可溶性糖和淀粉质量分数大幅降低。由此可以初步认为，花芽分化期间，根作为营养库需不断向芽体输送营养物质。芽体中较高含量的淀粉和可溶性糖有利于花芽分化的进行，而此后的含量减少是由于侧金盏花花芽形态分化需要大量的能源供给造成的。芽中可溶性糖质量分数在花芽分化始期瞬时升高，可作为侧金盏花花芽形态分化的显著生理标志。

可溶性蛋白既是成花转化的结构物质，又是不可缺少的营养物质，是植物花芽分化的物质基础。臧纱纱研究表明[31]，线辣椒叶片内可溶性蛋白质量分数在芽生理分化期达到峰值，此后逐渐下降，从萼片分化期到花芽分化结束保持平稳状态。郭金丽[32]认为，苹果梨生理分化期花芽和花枝中蛋白质大量积累，形态分化期由于各花器原基形态分化需大量蛋白质用于器官建成，造成花枝中蛋白质质量分数持续下降。本试验研究结果表明，花芽未分化期根中和芽中可溶性蛋白质量分数处于一个较低的水平，而在花瓣分化期质量分数达到峰值。说明较低质量分数的可溶性蛋白质有利于花芽形态分化的起始，而较高质量分数的可溶性蛋白质则促进花瓣和雌蕊的分化。与汪晓谦等[28]在郁金香花芽分化的研究结果相一致。

4.3 抗氧化酶活性对侧金盏花花芽分化的影响

除了营养物质外，花芽分化还需要一系列的酶类参与调控。SOD、POD、CAT作为植物细胞内主要抗氧化酶类，具有重要的生理功能，可更好地维持细胞内氧自由基浓度的平衡，保护花芽顶端分生组织免受活性氧的毒害作用，使花芽分化得以有序进行[33-34]。大量研究表明，花芽分化伴随的抗氧化酶类活性的增强。SOD、POD、CAT活性增强有利于花芽分化[35]，本试验研究结果也支持这一观点。在侧金盏花的花芽分化过程中，芽中抗氧化酶活性均明显高于根中；芽中SOD、POD活性在萼片分化期达到峰值后逐渐下降，CAT活性在雄蕊分化期达到峰值。说明不同的酶对花芽分化调控作用的时期不同。这与胡静等[33]在西红花花芽分化研究结果一致。

5 结论

侧金盏花在夏眠期完成花芽分化，其形态分化进程可分为未分化期、分化始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期6个时期。淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白等营养物质质量分数及SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性的变化，对侧金盏花花芽分化具有明显的调控作用。花芽分化之前根中淀粉和可溶性总糖质量分数随着花芽分化进程逐渐被消耗，芽中淀粉和可溶性总糖质量分数，在花芽分化始期快速积累，随后由于花芽分化消耗而逐渐减少。根和芽中可溶性蛋白质量分数总体呈先升高后降低趋势，在花瓣分化期达到最大值。花芽分化期间芽中抗氧化酶活性均明显高于根中，芽中高浓度的可溶性糖、可溶性蛋白以及高活性的SOD、POD、CAT有利于促进侧金盏花的花芽分化。有关侧金盏花花芽分化过程中激素的调控作用及分子生物学机制有待于进一步研究。