朱静,师亮,任昂,刘锐,赵明文

(南京农业大学生命科学学院/农业农村部食用菌加工重点实验室,江苏 南京 210095)

食药用菌自古被称为山珍,含有丰富的膳食纤维和活性成分,具有极高的营养价值和药用价值。灵芝,俗称赤芝,作为一种著名的大型药用真菌,能产生大量的具有生物活性的化合物,具有极高的营养保健价值和经济发展前景。栽培过程中生长调节剂以及温度、光照等环境因素,栽培基质中碳源、氮源、矿物元素等营养成分,均能显著影响灵芝的品质形成。虽然目前通过改变环境条件和基质营养能够提高灵芝三萜的含量,但是其中的分子调控机制不清晰。灵芝三萜的生物合成是遗传、基质营养、栽培环境三者相互作用的结果,从分子生物学角度解析基质营养和栽培环境调控灵芝三萜合成的机制,能够为利用栽培环境优化和基因工程技术,提高灵芝活性成分含量提供理论基础。

1 灵芝的活性成分及药用价值

灵芝最早记录于我国东汉年间第一部药物学著作《神农本草经》,被认为有“扶正固本”“滋补强身”的功效,在民间被誉为“不死草”“仙草”。灵芝为担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma)真菌。作为重要的一种白腐真菌,灵芝在世界各地均有分布,其中绝大部分生长在热带、亚热带和温带地区,我国亦是灵芝资源分布广泛的地区。灵芝子实体于夏、秋季单生、群生或丛生在阔叶树和松科等木桩、根际或树上,具有很强的降解纤维素和木质素的能力[1]。

作为我国传统的名贵中药材,灵芝具有极高的营养保健价值和广阔的应用前景。研究人员已经从灵芝的子实体、孢子和菌丝等组织中分离得到约100种生物活性成分,主要包括多糖、三萜、蛋白质、类固醇、甾醇、核苷酸等,具有免疫调节、抗病毒、抗炎、保肝等作用[2-3],其中三萜类是目前灵芝中主要研究的生物活性物质。灵芝三萜类化合物由6个异戊二烯单元组成,主要有五环三萜和四环三萜2类,按分子所含碳原子数可分为C30、C27、C24三大类,相对分子质量为400～600。灵芝三萜化学结构复杂,本身高度氧化,常温下为固体粉状,难溶于水,多数具有苦、涩味。研究表明萜类表现出较强的清除自由基和降低炎症反应的作用[4],可以直接抑制癌细胞的生长和扩散以及诱导癌细胞凋亡[5],并通过抑制转录因子NF-κB的DNA结合活性来实现降低炎症反应[6],增强细胞免疫反应以及延长寿命[7]等功能。

2 灵芝三萜的生物合成途径及其参与合成的基因

三萜类化合物目前已分离出140余种,其分类可以根据分子中所含碳原子数,分为C30、C27以及C24三大类;也可根据官能团和侧链不同,分为灵芝酸、灵芝内酯、赤灵酸、灵芝醇等十余种[8]。1992年,Shiao等[9]将5-13C标记的甲羟戊酸加入发酵液培养基中,利用同位素示踪技术在三萜产物中检测到了13C标记的3α和3β类型的灵芝三萜,证明灵芝三萜通过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA pathway)合成。其具体合成路径见图1。合成灵芝三萜的最初底物是乙酰辅酶A,由角鲨烯-2,3-环氧化经环化产生原甾醇,原甾醇通过随后的主链重排产生关键的中间代谢物羊毛甾醇。目前研究表明有11个酶参与了羊毛甾醇的合成[10],其中HMG-CoA还原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)、鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)、氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)被认为是合成羊毛甾醇的限速酶[11]。灵芝三萜属于高度氧化的羊毛甾醇衍生物,结构复杂多变。通过对灵芝的基因组学分析发现了大量的细胞色素P450,包括24个P450基因簇以及78个P750基因[1]。羊毛甾醇经过不同的细胞色素氧化酶氧化、还原和酰化等反应生成结构不同的灵芝三萜。

图1 灵芝三萜生物合成途径[9-10]Fig.1 The biosynthesis pathway of ganoderic acids[9-10]ACAT:乙酰辅酶A乙酰基转移酶 Acetyl-CoA acetyltransferase;HMGS:3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase;HMGR:3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase;MVK:甲羟戊酸激酶 Mevalonate kinase;MVD:焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶 Pyrophosphomevalonate decarboxylase;IDI:异戊二烯焦磷酸异构物酶 Isopentenyl diphosphate isomerase;FPS:法呢酯焦磷酸合酶 Farnesyl diphosphate synthase;SQS:鲨烯合酶 Squalene synthase;SE:鲨烯环氧化酶Squalene epoxidase;OSC:羊毛甾醇合酶 2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase;CYP51:甾醇-14α-去甲基酶 Sterol 14α-demethylase.

3 环境条件调控灵芝三萜的生物合成

由于灵芝液体发酵具有培养周期短,发酵条件容易控制,产量和质量稳定等优点,因此,用灵芝的发酵物开发灵芝产品也是一个趋势。针对灵芝液体发酵条件的研究,主要集中在发酵条件以及外源添加化合物方面。表1汇总了发酵条件及外源添加物对灵芝三萜合成的影响。通过优化培养基的pH、碳氮源、溶氧量、光照、添加的化学试剂(如茉莉酸甲酯、水杨酸等),可以显著影响灵芝三萜的合成。尽管这些优化研究方案在应用上具有一定的价值,但是在实际生产中培养基成分相对复杂且各成分之间存在交互作用,传统的发酵条件并不利于开展灵芝三萜生物合成机制的研究。

表1 影响灵芝三萜生物合成的条件Table 1 Conditions affecting ganoderic acid biosynthesis

4 参与灵芝三萜合成的相关蛋白对灵芝三萜合成的调控

2012年Chen等[1]首次报道了灵芝单核菌株260125的全基因组序列,其基因组大小约43.3 Mb,预测编码了16 113个基因,其中含有大量的细胞色素P450家族基因及纤维素和木质素降解基因,并且大部分属于灵芝中特有的编码基因。灵芝基因组测序的完成为灵芝功能基因组学研究提供了宝贵的序列信息,为研究灵芝三萜的生物合成及调控奠定了基础。

4.1 直接参与灵芝三萜合成的关键蛋白对灵芝三萜合成的影响

许多研究对灵芝三萜生物合成途径中的多个关键酶的基因进行了克隆分析:包括鲨烯合酶[31]、羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶[32]、法呢酯焦磷酸合酶[33]、羊毛甾醇合酶[34]、羟甲基戊二酰辅酶A 合酶[35]和鲨烯单加氧酶、乙酰乙酰辅酶A 乙酰基转移酶[36]、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸脱羧酶[37]以及细胞色素P450 还原酶基因等[38]。进一步研究发现该途径中基因的表达量与灵芝三萜含量密切相关。例如:利用固体培养基培养灵芝菌丝时,与液体培养相比,角鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)和羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase,LS)基因的转录水平显著升高,胞内灵芝三萜的含量也显著升高[39]。此外,添加钠离子或者锰离子也能够显著提高hmgr、sqs和ls基因的转录水平,与未添加相比灵芝三萜含量分别提高了2.8和2.2倍[40]。乙烯的添加能够显著提高sqs、ls、hmgs以及cyp51的转录水平,灵芝三萜的含量提高约1.05倍[29],但是灵芝三萜含量与灵芝三萜合成途径中的基因转录水平并不总是正相关。随着遗传转化体系的建立,通过农杆菌转化技术将这些基因(如甲羟戊酸脱羧酶[37]和灵芝甾醇14α-脱甲基酶[38])进行过表达后,结果表明灵芝三萜含量分别提高了约1.0和1.6倍。

4.2 间接参与灵芝三萜合成的关键调控蛋白对灵芝三萜合成的影响

除了对直接参与灵芝三萜合成途径的蛋白进行研究分析之外,近年来针对灵芝三萜生物合成关键调控蛋白的研究也成为热点。通过比较不同三萜合成水平下的灵芝转录组差异,筛选到一些调控蛋白,涉及多种酶类、信号转导相关蛋白以及一些转录因子等[29]。进一步通过RNA干扰技术沉默单一基因后,发现交替氧化酶(AOX)[41]、NADPH氧化酶(NOX)[42]及多胺合成关键酶(ODC)[43]基因沉默后能够通过影响胞内ROS稳态进而参与调控灵芝三萜含量。在高温处理灵芝菌丝后,发现磷脂酶D(PLD)和磷脂酸(PA)介导了灵芝三萜的生物合成[19,44]。此外,还发现多种转录因子参与灵芝三萜的生物合成,如响应环境pH的转录因子PacC、APSES型转录因子Swi6、参与氮代谢的关键转录因子AreA和GCN4[14,16,45-47]。虽然现阶段研究发现一些关键调控蛋白在灵芝三萜生物合成中具有重要作用,通过基因工程也能提高灵芝三萜含量,但采用单个基因调控的方式提高灵芝三萜含量已经接近瓶颈,因此,为了进一步提高灵芝三萜含量,通过深入解析具体调控机制,完善灵芝三萜生物合成调控网络已成为当务之急。

5 信号分子参与调控的灵芝三萜的生物合成

许多信号分子在灵芝三萜生物合成的调控中发挥着关键作用,包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)、钙离子、一氧化氮(NO)以及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)等信号。这些信号分子在植物和动物中均参与各项生理活动,但在微生物中,特别是大型担子菌中的研究近年来才刚起步。

5.1 ROS信号

活性氧包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基,它作为信号分子能够参与调节细胞的生长、发育和代谢等生理过程。在灵芝中,ROS可以诱导许多参与灵芝三萜生物合成的基因表达,如hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs、osc、acat、se和cyp51,进而调控三萜合成[48]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶以及线粒体是胞内ROS的重要来源,它们通过调控胞内ROS的含量进而影响灵芝三萜的合成[28,42]。参与清除胞内活性氧的谷胱甘肽过氧化物酶,能够通过调控灵芝细胞内的ROS水平,进而调控灵芝三萜的生物合成和菌丝分叉[49]。在前期对ROS产生及清除酶系的系统研究基础上,进一步解析了ROS信号通路对灵芝三萜生物合成的影响,发现可以采用乙酸提高胞内的ROS水平,进而提高灵芝三萜的生物合成。当采用富氢水降低胞内ROS水平后,胞内灵芝三萜的生物合成降低。进一步的机制研究发现,富氢水可以通过激活灵芝体内的GPX活性以及提高细胞内的还原型谷胱甘肽含量来降低胞内的ROS水平[50]。此外,某些功能蛋白如转录因子PacC、SKN7和slt2/MAPK等功能的缺失,也能够调控灵芝胞内ROS的含量[46,51]。大量研究表明,胞内ROS含量的变化能够显著影响灵芝三萜的生物合成,但具体分子调控机制目前仍不清晰。

5.2 NO信号

NO是一种具有较高自由基活性的气体分子,能作为信号分子在胞内传递信号,在生物生长发育过程中起重要的调控作用。NO是影响细胞次级代谢产物合成的重要信号分子,能够显著影响人参皂苷、青蒿素等次级代谢产物的生物合成。虽然对NO生物学功能的研究大多集中在动物和植物研究中,但是人们在真菌的研究中也逐渐发现了NO具有重要的调控作用。在灵芝中胞内NO能够缓解由于热胁迫造成的灵芝三萜含量的积累[20,52]。转录因子AreA能够通过调控胞内NO含量抑制灵芝三萜的生物合成[14];而与之相反的是,茉莉酸甲酯的添加能够激活硝酸还原酶的活性,进而产生大量的NO促进了灵芝三萜的生物合成[53]。这些结果显示NO在不同条件下可能具有双向调控作用。通过进一步对NO调控灵芝三萜合成的机制进行深入研究,发现NO作为一种活跃的气体信号分子,能够通过S-亚硝基化和硝基化2种翻译后修饰方式,影响靶蛋白结构、稳定性、酶活等性质,从而参与调节多种生物学功能[54]。目前研究显示,亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)是蛋白质亚硝基化修饰所需亚硝基的主要来源之一。GSNOR介导的S-亚硝基化修饰能够抑制灵芝三萜的生物合成[55]。胞内NO还能与超氧阴离子生成过氧化亚硝酸盐,而过氧化亚硝酸盐可以在体内或者体外使酪氨酸残基酚环的3位发生蛋白酪氨酸硝基化。研究表明NO能够通过硝基化修饰抑制灵芝谷氨酰胺合成酶的活性,进而降低胞内谷氨酰胺的含量,最终抑制灵芝菌丝的生长及灵芝三萜的生物合成[56]。在灵芝中已经开展了对NO的2种翻译后修饰的研究,但仅仅针对2种功能酶的研究,NO是否能够通过翻译后修饰调控灵芝三萜合成途径中的关键酶,是否能够通过更广泛的调控,从而影响关键转录因子或者其他信号通路影响灵芝三萜的生物合成,仍需深入研究。对这些调控机制的研究能丰富我们对NO与真菌次级代谢调控网络关系的认识。

5.3 钙离子信号

钙离子作为胞内重要的第二信使,能够调节生物体的基因表达以及响应生物和非生物胁迫过程[57]。胞内钙离子能够通过影响钙离子与转录因子的结合能力,激活钙调蛋白(CaM)、钙离子依赖蛋白激酶、CaM结合蛋白激酶、CaM激酶等,磷酸化或去磷酸化下游转录因子,进而激活或抑制下游相关基因的转录表达[58]。钙信号对于次级代谢产物的调控在植物和真菌中均有研究报道。例如:Ca2+/钙调蛋白结合蛋白DWF1对于油菜素内酯的合成至关重要[59];在人参中,外源添加钙离子是提高人参皂苷合成的一个有效的方法[60];钙离子的添加虽然能够促进尾孢菌的菌丝生长,但是却导致尾孢菌素含量下降[61]。在前期研究中发现,在灵芝液体培养时,外源添加10 mmol·L-1钙离子能够显著提高灵芝三萜的生物合成水平;当添加环孢素A或者氯丙嗪抑制钙离子内流后,hmgr、sqs和ls的转录水平显著下降[22]。在灵芝栽培试验中,添加钙离子也提高了子实体中灵芝三萜的合成水平[62]。进一步研究发现热胁迫能够通过提高胞内钙离子的含量提高灵芝三萜的含量,并且在这一过程中钙离子通道蛋白(CCH)、磷脂酶C(PLC)以及CaM发挥了重要的作用[63]。在大型真菌中,钙离子信号对于次级代谢调控的研究报道较少。因此,研究钙信号调控灵芝三萜的生物合成水平对提高灵芝附加值具有重要意义。

5.4 其他信号

研究发现除了上述信号分子参与灵芝的生长及次级代谢外,越来越多的信号分子也被发现具有重要的生理功能,如H2S信号、cAMP信号、磷脂信号等。同时,进一步研究也发现各个信号分子之间相互影响。外源添加H2S供体和清除剂,发现热胁迫能够提高胞内H2S含量,升高的H2S能够通过抑制胞内钙信号,降低胞内灵芝三萜的积累。通过转录组学研究,进一步揭示了H2S能够影响胞内ROS、NO、AMPK、磷脂等信号[64]。细胞内cAMP水平的增加会引起胞内的氧化磷酸化复合蛋白过表达,诱导灵芝三萜的产生[30]。Gu等[48]报道NO可以通过作用于ROS和MAPK的信号,间接影响三萜合成基因的表达;Liu等[20]报道发现外源添加NO供体能够增加灵芝菌丝中Ca2+的含量,并且热胁迫诱导的NO产生也需要Ca2+信号参与。此外,NO也能够通过抑制顺乌头酸酶活性降低线粒体中ROS含量,从而抑制灵芝三萜的积累[55]。磷脂酰肌醇(PI)能够在磷脂酰肌醇激酶的催化作用下转变为4,5-二磷酸肌醇(PIP2),PIP2作为信号分子,促进了胞内钙离子的增加[19]。当添加阿司匹林诱导细胞凋亡后,发现灵芝三萜含量显著升高了2.7倍,但是sqs和ls的转录水平却下降[30]。对于不同信号参与及互作调控灵芝的生长发育及次级代谢的机制研究,为今后利用相关生长调节剂调控灵芝三萜含量提供了技术手段。

6 环境因子通过调控功能基因及信号分子调控灵芝三萜的生物合成

环境因子对灵芝三萜生物合成的影响往往不是通过单一基因或单一信号分子调控的,而是多种调控基因及信号分子参与的复杂调控网络。

6.1 高温信号

高温胁迫能够影响几乎所有生物的生长、发育和次生代谢等生理过程。高温是灵芝栽培过程中最常遇到的胁迫,灵芝能够激活多种信号通路或功能蛋白来感知响应环境温度的变化,通过对代谢及细胞功能的调控,防止过热对细胞造成损伤或死亡,同时提高灵芝三萜的含量。在高温条件下,灵芝GSNOR活性增强,而由GSNOR介导的S-亚硝基化修饰抑制了顺乌头酸酶的活性,从而降低了线粒体内的ROS含量,最终抑制了灵芝三萜的生物合成[55]。热胁迫条件下增加的GSNOR酶活性能够通过S-亚硝基化修饰过氧化氢酶的第401、642和653位的半胱氨酸位点,抑制过氧化氢酶的活性,进而抑制灵芝三萜的生物合成水平。高温胁迫还可以提高灵芝胞内Ca2+含量,调控菌丝分叉以及提高灵芝三萜生物合成[63];H2S能够影响灵芝体内多重信号转导途径,如通过负调控胞内钙信号来抑制由热胁迫导致的灵芝三萜含量升高[64]。在高温条件下,灵芝的细胞膜流动性增强;当采用化学试剂降低细胞膜流动性时,灵芝三萜的含量也随之降低,说明热胁迫通过改变细胞膜流动性来影响灵芝三萜的生物合成[44]。高温也可以通过诱导热休克蛋白的转录表达、提高Del-9脂肪酸脱氢酶活性等来提高灵芝菌丝对高温胁迫的耐受性。Hu等[65]发现当灵芝遭遇热胁迫时,灵芝snf1被迅速激活以及胞内ROS迅速增加。激活的snf1通过对胞内代谢流的重新分配,将呼吸转向无氧糖酵解产生大量的还原力,以抵御热胁迫产生的ROS。这些研究结果表明高温条件能够通过调控多种信号通路及功能基因,进而提高灵芝三萜的生物合成。

6.2 营养信号

碳源和氮源是灵芝生长发育过程中的重要元素。改变培养环境中碳源和氮源的种类和浓度能够显著影响灵芝三萜的生物合成,并且其对灵芝三萜生物合成的影响不同。与添加葡萄糖相比,添加微晶纤维素或D-半乳糖作为碳源时,可以显著增加三萜含量[13]。不同的氮源种类以及浓度对灵芝的次级代谢也有显著影响。如低浓度的硫酸铵、谷氨酰胺和天冬酰胺的培养条件有利于促进灵芝三萜合成相关基因的表达[15]。与高浓度的天冬酰胺为唯一氮源相比,当用低浓度的天冬酰胺培养时,灵芝菌丝内ROS显著增加,有利于灵芝三萜的积累。此时,全局性转录因子GCN4被激活,GCN4通过调控清除ROS相关酶的转录和活性水平,以防止胞内ROS爆发对菌丝的伤害[16]。当灵芝菌丝利用硝酸盐为唯一氮源进行培养时,转录因子AreA被激活,通过促进硝酸还原酶的转录,进而促进菌丝对硝酸盐的吸收和利用以维持生长[14]。但是在这一过程中产生的大量NO抑制灵芝三萜的合成,同时NO还通过翻译后修饰抑制氮源吸收、利用过程中的谷氨酰氨合成酶活性,进而抑制胞内谷氨酰胺合成,最终抑制灵芝三萜的合成水平[56]。以上结果表明,在培养过程中使用初级碳源、次级氮源以及低浓度氮能够促进胞内灵芝三萜的积累。

6.3 化合物信号

在灵芝培养中,通过添加植物激素和其他化合物,如水杨酸、茉莉酸甲酯、乙酸及阿司匹林等,能够通过调节胞内ROS信号、NO信号及线粒体功能等提高灵芝三萜的生物合成。使用200 mmol·L-1水杨酸处理后灵芝三萜的含量提高了约1.5倍[27]。水杨酸通过抑制线粒体复合物Ⅲ的活性,导致ROS过量产生,从而诱导灵芝三萜的生物合成[28]。茉莉酸甲酯处理灵芝菌丝会激活NADPH氧化酶,产生大量的ROS信号,进而促进灵芝三萜的积累[66]。但是也有研究表明,茉莉酸甲酯处理能通过诱导硝酸还原酶活性的提高,产生NO信号分子,进而促进灵芝三萜的生物合成[53]。这些结果表明,多种信号分子及功能基因能够相互作用,共同调控灵芝三萜的生物合成。

7 应用与展望

萜烯类化合物在许多中药材中广泛存在,并且具有重要的经济价值,如灵芝三萜、人参皂甙、紫杉醇、青蒿素等。因此,对萜烯类化合物生物合成机制的研究具有重要的意义。灵芝三萜是一种重要的药用资源,目前国内外对它的研究主要集中在该类化合物的分离和药理特性上,而对其生物合成及其调控机制的研究较少。研究灵芝三萜生物合成及其调控机制,对提高其产量从而进一步提高灵芝的药用价值有着深远的影响。

基质中碳源、氮源、矿物元素等营养成分,培养过程中生长调节剂以及环境胁迫如温度、光照等环境因素均能影响灵芝三萜的生物合成。因此,通过改变营养和环境条件能够提高灵芝三萜的含量,但是灵芝三萜的生物合成是遗传、培养基质营养、环境三者相互作用的结果。从分子生物学角度解析灵芝三萜合成的机制,利用环境优化和基因工程手段,可为提高灵芝活性成分含量提供研究基础。灵芝有异核菌丝,生活史特殊,而对其遗传及生理研究的平台缺乏,相关基础理论研究匮乏,因此研究难度较大,且分子技术创新受到严重制约。阐明灵芝优良品质形成的调控途径,能够为高品质灵芝生产提供创新的理论依据和路径指导,形成优质生产的新技术、新方法,使灵芝的生产逐渐从经验化走向科学化,对提高我国药用真菌产品在国际市场的竞争力具有重要意义。

目前,对灵芝的研究主要围绕着灵芝的主要药用成分(灵芝三萜)的生物合成机制上,并开展了环境调控灵芝三萜生物合成的研究工作。虽然越来越多的化学信号、物理刺激以及营养条件被证明参与了灵芝三萜的生物合成调控,其中存在的分子机制也逐渐被认识[67],但是在实际培养灵芝过程中的应用却较少。目前发现通过在子实体生长过程中外源喷洒水杨酸和乙酸,或者添加适当的钙离子,能够显著促进灵芝子实体生长并提高灵芝三萜的含量[62]。这些研究为生产中提高灵芝三萜的含量提供了有效的技术手段。今后应进一步将理论和应用相结合,通过精准调控培养过程中灵芝三萜的含量,为提高灵芝品质开发新技术。

虽然近年来已建立了简便易行的灵芝遗传操作体系,如灵芝的过表达体系、RNA干扰技术,但是现阶段仍未有如模式生物一样的研究平台,有关灵芝的遗传操作体系也相对较少。因此,今后要建立新的转化筛选标记技术,例如营养缺陷性和草甘膦抗性,并建立基因敲除技术(如CRISPR技术)。通过完善遗传操作体系并结合生理学研究,使灵芝成为潜在的研究药用真菌次级代谢的模式菌种,为进一步提高灵芝品质提供理论基础,并为其他药用真菌次级代谢的调控提供技术支撑。