李娟娟，赵文兵，周 健，周建云

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨陵 712100；2.汉中市天台山森林公园管理服务中心，陕西 汉中 723000；3.佛坪秦岭生态保护中心，陕西 佛坪 723400；4.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵 712100)

党参(Codonopsispilosula)是桔梗科(Campanulaceae)党参属(Codonopsis)多年生草本，为中国常用大宗药材。陕西省凤县产的党参俗称“凤党”，据《凤县志》和《凤县民国志》等资料记载：“凤党”以名贵质优享誉，远销于东南亚、日、韩等地，清末作为上等贡品为朝廷进贡。随着近年来人们对其需求日益增长，野生资源日益减少[1-4]。因此，对“凤党”进行组织快繁培养，以便大面积的人工栽培扩大药源十分必要。与传统繁殖方法相比，植物组织培养快繁技术能在较短的时间内提供大量优异基因型的种苗，在许多植物中广泛应用，越来越受到人们的重视。关于党参的研究报道主要集中在生物学特性、化学成分、栽培技术等方面，对其离体快繁技术鲜有报道[5-8]，“凤党”的组织培养研究尚未见报道。本文以“凤党”茎段为外植体，研究植物生长调节剂对愈伤组织诱导和芽分化，以及生根的影响，初步建立植株再生体系，为工厂化生产优质种苗提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

采集陕西省凤县留凤关镇种植基地“凤党”优良单株种子，用自来水冲洗干净，无菌水浸泡过夜。用75%的酒精消毒30 s再用0.1% HgCl2溶液消毒10 min后，无菌水冲洗5次，接种于添加2%蔗糖和0.6%琼脂的MS基本培养基上进行萌发培养。以种子萌发无菌苗的嫩茎为外植体进行愈伤组织诱导。

1.2 方法

将幼茎切成约1 cm的茎段，接种于MS基本培养基，其中添加不同质量浓度NAA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1)组合的愈伤组织诱导培养基上培养4周，统计愈伤组织诱导率(出愈率)。

出愈率(%)=(形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数)×100

(1)

将增殖的愈伤组织转入附加不同质量浓度6-BA(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)和NAA (0、0.1、0.5 mg·L-1)组合的MS基本培养基,诱导不定芽的分化，定期观察并记录分化情况及再生芽的生长状况，4周后统计分化率[9-10]。

分化率(%)=(出芽块数/接种愈伤组织数)×100

(2)

再生丛芽生长至3.0～4.0 cm高时，切割成单芽,转入不同质量浓度IBA(0、0.2 mg·L-1)和NAA(0、0.2 mg·L-1)组合的MS、1/2MS培养基上进行生根培养，30 d后统计生根率。

生根率(%)=(生根芽数/接种芽数)×100

(3)

所有培养基均添加 30 g·L-1蔗糖、6 g·L-1琼脂(产地:北京)，pH调至5.8，于 121 ℃高压湿热灭菌 20 min。培养条件为培养室温度25±2 ℃，光强为2 000 Lx，16 h光照。每个处理接种30瓶，每瓶接种3个外植体。

所有数据均在Excel 2016软件中完成处理，并以平均值±标准偏差形式表示；SPSS 20.0软件进行数据统计分析，其中包括方差分析、Duncans多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

无菌苗幼茎在不同处理培育4周后，可看到茎段伤口处凸起，经脱分化形成愈伤组织。方差分析表明，植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响显著(P<0.05) 。培养基中添加0.5 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，愈伤组织长势旺盛，呈亮黄色，出愈率达99%，当培养基中添加1.0 mg·L-1NAA和3.0 mg·L-16-BA时，出愈率最低(表1)。

表1 不同植物生长调节剂处理愈伤组织诱导率

2.2 植物生长调节剂对不定芽分化的影响

将增殖的愈伤组织在添加不同浓度6-BA和NAA激素的MS培养基上培养4周后都发生了较好的分化，形成了较多的不定芽(表2、图1B、C)。其中处理5(0.1 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-16-BA)愈伤组织分化率最高，为100%，产生的芽较多且壮，处理7(0.5 mg·L-1NAA、0.2 mg·L-16-BA)的分化率最低，为82%，芽较多且壮。由分化率的显著性分析可知，处理5组和6组之间的分化率差异不显著且都高于其他组，处理1、7、8组之间的分化率差异不显著且都低于其他组。

表2 不同植物生长调节剂对不定芽分化的影响

2.3 生根培养

将长至3.0～4.0 cm高的丛生芽切割成单芽转入不同质量浓度IBA(0、0.2 mg·L-1)、NAA(0、0.2 mg·L-1)组合的MS、1/2MS培养基，在一定培养条件下诱导根的发生(图1)，培养30 d后统计其生根率和根的生长情况(表3、图1D)。处理6(1/2MS培养基、0.2 mg·L-1NAA、0.2 mg·L-1IBA)的生根率最高,为97%,且与其他处理组的生根率差异显著，根的长势旺盛，处理1组的生根率最低,为37%，根的生长情况一般。

注：A.愈伤组织上再生植株；B.不同培养基上再生效果比较；C.再生芽继代培养；D.生根状。

表3 不同基本培养基及植物生长调节剂对生根的影响

2.4 驯化移栽

待根长至1～2 cm时，开瓶2 d，小心洗去上面残留的琼脂培养基，移入体积比(腐殖质)∶体积比(蛭石)=1∶1的基质中，湿度保持在90%、自然光50%的条件下，培养15 d转移到通风透光处，获得“凤党”植株。

3 结论与讨论

3.1 不同植物生长调节剂处理对植株愈伤组织诱导的影响

在诱导植株愈伤组织和再生体系的形成中，植物生长调节剂的种类和配比是影响其生长的重要因素[1]，通常使用细胞分裂素和生长素相结合的办法提高愈伤组织的愈导率[11-12]，其中6-BA是比较常用的细胞分裂素，NAA和IBA是常用的生长素[13-14]。

本研究发现，当NAA的浓度为0.1 mg·L-1，6-BA质量浓度从1.0 mg·L-1逐渐增大时，“凤党”愈伤组织的出愈率逐渐减少，说明高浓度的6-BA对“凤党”愈伤组织诱导有不利影响。这与姚凤琴等[4]、鲁青青等[5]的研究结论一致，当6-BA浓度不变，NAA的质量浓度逐渐增大时，茎段出愈率先增加后降低，这有可能是因为只有生长素和细胞分裂素平衡时，才能更好地促进茎段愈伤组织的生长，进一步说明生长素和细胞分裂素的配比是影响植株愈伤组织形成的重要因素[15-17]。

综上所述，本研究中最优组合MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA，茎段出愈率最高，为99%。张延红等[6]利用党参茎段在不同浓度配比的MS培养基中得到诱导愈伤组织的最佳组合为MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA，出愈率为90%，唐玉倩等[8]通过0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT的处理得出茎段愈伤组织的诱导率为90%，彭金环等[9]在轮叶党参再生培养过程中得出0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA可以促进愈伤组织的分化。由此可以看出，本研究中的激素组合所得的茎段的出愈率最高99%，明显优于其他几组研究结果。即MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA的组合对于党参茎段愈伤组织的诱导具有很好的效果。

3.2 不同植物生长调节剂处理对不定芽诱导的影响

仅添加6-BA且质量浓度逐渐增大时，芽的分化率依次增大，芽的数目变多、细弱程度增加。当NAA质量浓度分别为0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1，6-BA质量浓度依次增加时，芽的变化情况和NAA浓度为0.0 mg·L-1基本一致，说明6-BA的质量浓度变化对芽生长影响最为显著，NAA对芽的影响不明显，但低质量浓度的NAA(0.1 mg·L-1)可以降低芽分化中的变异。

本研究利用9种不同的培养基诱导不定芽的分化，对比9组数据得到MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA培养基为最佳不定芽的诱导培养基，分化率为100%。张延红等[6]在对芽的诱导中得出最佳激素组合为MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA、MS+0.1 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA，分化率均为100%，张雪君等[7]在对党参丛生芽的诱导过程中发现0.1 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA组合，分化率最高为90%，但丛生芽矮化情况严重，当激素组合为0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA时，芽分化率为62.5%，但丛生芽的生长情况良好，彭金环等[9]在对党参再生苗的诱导中发现，1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA的培养基，分化率最高达89.4%。通过以上几组数据可以看出，此次芽诱导所选择的激素组合能够高效促进芽的诱导，是较优良的芽诱导激素组合。

3.3 不同植物生长调节剂对生根培养的影响

用6种不同的培养基对再生苗进行生根培养。对比观察其生根状况，得出1/2 MS+IBA 0.2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1为最佳生根培养基，生根率97%。由表3可以看出，不管是MS培养基还是1/2 MS培养基，2种激素都添加比只添加NAA或IBA中一种激素时根的生长情况好，说明在根的生长过程中生长素和细胞分裂素的配比使用有助于促进根优良生长，当NAA和IBA质量浓度一定(0.2 mg·L-1)，1/2 MS培养基中芽的生长情况优于MS培养基。综上所得，培养基的种类、NAA和IBA的浓度对根的生长都有显著的影响。

彭金环等[9]在轮叶党参的组织培养过程中，得到1/2 MS+0.2 mg·L-1IAA+0.2 mg·L-1NAA下培养再生苗的生根率最高为92.5%，张雪君等[7]在对党参不定根的培养中发现1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+40 g/L蔗糖为不定根的最佳培养基。综合本研究的最佳培养基(1/2 MS+IBA 0.2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1)来看，在党参组培中不同的激素组合对不定根的影响较大，且党参最佳基础培养基为1/2 MS培养基，其他激素和蔗糖等物质的组合都具体按照外植体种类和生长的环境条件等决定。对比本研究和彭金环等[9]的最佳生根培养基可以看出，培养基相同，但外植体的采集时间和外植体的种类都有可能影响根的生长。

本研究以优株种子培养所得无菌苗的茎段为材料，MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA培养基中诱导愈伤组织，愈伤组织接种在MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA培养基中诱导植株再生，生根培养基用1/2 MS+IBA 0.2 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，当根长至1～2 cm时开始炼苗移栽，基质用体积比(腐殖质)∶体积比(蛭石)=1∶1，建立的优良种质的快速繁殖技术，为“凤党”的标准化栽培奠定了基础。