何显杰

清丰县农业农村局，河南清丰 457300

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织发生病理机能变化的防御应答反应[1]，大多数病例由病原微生物侵染奶牛机体内部而引发，对奶牛泌乳性能、乳汁理化特性和生理繁殖机能等造成不利影响，成为奶牛疾病防控的重要内容。致病性细菌是奶牛乳房炎的主要致病因子，种类较多，尽管奶牛乳房炎致病菌存在区域差别，但金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，约占细菌性乳房炎的70%以上[2]。在长期兽医临床治疗中，抗生素在防控细菌性奶牛乳房炎方面发挥了重要作用，但也带来了牛奶抗生素残留超标、耐药菌株不断增多等严重问题。

中草药来源广泛，存在于动植物和矿石等中，具有无毒或低毒、无污染、无残留和无耐药性等诸多优势[3]。很多中草药表现抗毒素和抑菌的药物功效，能够提高动物免疫力和机体的抗病能力，是很好的抗生素替代品。本试验根据中兽药理论，结合乳房炎致病机制，按照“清热解毒、抗菌消炎、消肿止疼和通经利乳”的配伍原则，选取10 种中草药应用于奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的体外抑菌试验，旨在筛选抑菌效果显著的中草药，为临床防治奶牛乳房炎的中草药研制和应用提供技术支持。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 中草药

板蓝根、蒲公英、紫花地丁、黄连、连翘、黄芩、金银花、鱼腥草、红花和大青叶，购自濮阳市天业药店。分别称取上述中草药20 g，用去离子水浸泡2～3 h，猛火煮开后调为文火，煮30 min，过滤，药渣中再加去离子水，煮20 min，过滤。2 次药液合并浓缩至药液浓度为1 g/mL，分装于玻璃瓶，4 ℃保存，备用。

1.1.2 菌株和培养基

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌来自清丰县部分奶牛场乳房炎奶牛，经分离鉴定得到。普通肉汤培养基、营养肉汤培养基（含2%小牛血清）由濮阳市动物疫病控制中心提供。

用接种环无菌挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种于普通肉汤培养基，无乳链球菌接种于营养肉汤培养基（含2%小牛血清），37 ℃培养18～24 h，3 种菌液复壮后，在紫外可见光光度计下比色，将波长调至625 nm处进行稀释菌液，当吸光度值为0.08～0.1时细菌浓度为1×108～2×108CFU/L即可，备用。

1.1.3 试验仪器

无菌操作台、高压灭菌锅、紫外可见分光光度计UV5，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；恒温箱、打孔器（孔径Φ＝3 mm）等，本实验室提供。

1.2 抑菌试验

根据参考文献[4]，采用试管二倍稀释法测定中草药对3 种细菌的最低抑菌浓度（MIC）。体外抑菌试验：取30 支5 mL灭菌试管，分成3组（1 种菌液1组），每组10 支试管，分别标记1～10号，每组每个试管中装入1 mL营养肉汤培养基，另在每组1号试管添加1 mL中草药液，摇匀，吸取1 mL混合液加入2号试管，以此类推，至8号试管（弃去1 mL），9号试管设为菌液空白对照，不添加中草药液，10号试管设为中草药液对照，不添加菌液。分别吸取0.05 mL制备后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌加入每组每个试管中，37 ℃培养24 h，与空白对照比较，以肉眼观察培养基清亮且未见细菌生长的最低浓度判定为该药物的最低抑菌浓度（MIC）。每组3 个重复，取重复数值多者为MIC值。

2 试验结果

2.1 中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果

连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC为15.63 mg/mL，其次为板蓝根、蒲公英、紫花地丁、黄芩、金银花、大青叶，MIC均为31.25 mg/mL（表1）。

表1 中草药对金黄色葡萄球菌抑菌试验结果

2.2 中草药对大肠杆菌抑菌试验结果

板蓝根、蒲公英和黄芩的MIC最低，为62.5 mg/mL，抑菌效果最好，其次为紫花丁、连翘、金银花和鱼腥草，MIC为125 mg/mL（表2）。

表2 中草药对大肠杆菌抑菌试验结果

2.3 中草药对无乳链球菌的抑菌试验结果

紫花丁的MIC最低为15.63 mg/mL，抑菌效果最好，其次为板蓝根、蒲公英、紫花丁、连翘、黄芩和金银花，MIC为31.25 mg/mL（表3）。

表3 中草药对无乳链球菌的抑菌试验结果

3 讨论

细菌是引起奶牛乳房炎的主要病原微生物，因此，杀灭或者抑制细菌生长繁殖是防治该病的关键。在我国实行饲料禁抗的大趋势下，中草药含有许多天然生物活性成分，抗菌消炎效果较好，是抗生素替代品的主要研究方向。谢成运等[5]应用黄芩、黄连、丹参、连翘等对奶牛乳房炎主要致病菌体外抑菌试验，发现中草药对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好。百合地开力地等[6]报道，金银花、鱼腥草、红花等对奶牛乳房炎主要致病菌（大肠杆菌、链球菌和绿脓杆菌等）的最小抑菌浓度均为15.63 mg/mL；丁月云等[7]研究发现，黄芩、大青叶、连翘等对猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果显著。朱晓萍等[8]研究黄连等中草药对常见病原菌的体外抑菌效果，结果显示，所选10 种中草药对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌均有不同程度的抑菌效果。本试验结果显示，连翘对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC为15.63 mg/mL；板蓝根、蒲公英和黄芩对大肠杆菌抑菌效果最好，MIC为62.5 mg/mL；紫花丁对无乳链球菌抑菌效果最好，MIC为15.63 mg/mL。与上述学者研究结果相同或近似。但是，体外抑菌试验对中草药的抗菌作用只能是一种参考性的方法，其实际临床应用效果还必须通过动物体内试验加以比较、验证，从而进一步阐明其抑菌机理。

4 结论

本试验10 种中草药对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌均具有不同程度的抑菌特性。该试验结果对临床应用中药防治奶牛乳房炎病具有一定的积极意义，为进一步筛选效果良好的抗菌中药复方提供参考。