姜焕焕，张嘉敏，何洪活，李丽梅，吴倩盈，黄 晓，王 通，

（1.肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061；2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100）

热激蛋白（Heat shock protein，HSP）是一类植物受不良环境胁迫后，大量表达以减轻逆境胁迫损伤的保护性蛋白.按照分子量大小可分为5类：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP20.其中HSP20分子量在12~42 kDa之间，是一类受逆境胁迫后迅速合成的小分子热激蛋白，以基因家族的形式存在于植物染色体中[1-2].HSP20基因家族分析已在多种作物中展开研究.拟南芥中鉴定出19个HSP20基因家族成员[3]，白菜中有27个HSP20基因家族成员[4]，辣椒中有35个HSP20基因家族成员[5]，在小麦和大麦中共发现40个HSP20基因家族成员[6].根据基因的细胞位置，序列同源性和基因功能分为多个亚家族.其中拟南芥HSP20基因家族分为12个亚族，分别为：CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI、CVII定位于细胞质或细胞核；MI、MII定位在线粒体；P定位于质体；PO定位于过氧化物酶体；ER定位于内质网[7].此外，关于HSP20基因家族的表达模式在多种作物中展开了研究.张宁等人[8]对番茄HSP20基因家族研究表明，其存在多个顺式作用元件，参与番茄逆境胁迫响应.孙宇栋等人[9]研究核桃的HSP20基因对温度胁迫响应的分子调控机理，结果表明核桃JrHSP20-1基因能够显著提升转基因酵母对高温和低温的耐受能力.郭猛[10]对辣椒CaHSP20基因家族的研究，表明其受逆境胁迫响应上调表达.植物HSP20基因没有单一表达模式，同一HSP20基因亚家族的成员也没有相同的表达模式.多种生物及非生物（高温、低温、干旱）胁迫能够诱导HSP20基因表达.

花生是我国重要的油料作物之一，其生长及品质受逆境胁迫影响.与栽培种相比，野生种花生具有较强的抗逆性.因此，全面鉴定和分析野生种花生HSP20基因家族结构与功能，对揭示其在花生生长发育过程及逆境胁迫响应的分子机理方面具有重要意义.野生种花生A.duranensis和A.ipaensis的全基因测序已完成，使得在全基因组水平挖掘和鉴定HSP20基因家族成员成为可能[11].本研究基于此基础，运用生物信息学方法对野生花生全基因组序列进行挖掘，鉴定全部HSP20基因家族成员，并对其染色体定位、系统发育关系、基因结构和表达特性进行分析，为研究花生HSP20基因家族的功能和抗胁迫反应机理提供了支持.

1 材料与方法

1.1 花生HSP 20基因的检索与鉴定

从Pfam（http:∕∕pfam.xfam.org∕）数据库中获得HSP20基因家族隐马尔可夫模型文件，再利用HMMER3.0软件对野生花生A.duranensis（Aradu.V14167.a1.M1）和A.ipaensis（Araip.K30076.a1.M1）的蛋白质组数据库进行搜索.将搜索到的HSP20基因序列提交到在线工具NCBI（Conserved Domain Search）和Pfam数据库中，进一步鉴定是否含有HSP20蛋白结构域.从花生基因组数据库（http:∕∕peanutbase.org∕）上获得基因信息.利用在线网站ProtParam（http:∕∕www.expasy.org∕）分析HSP20蛋白的理化性质.

1.2 花生HSP 20基因家族进化分析

从拟南芥数据库中下载HSP20基因组序列.将检索到的A.duranensis和A.ipaensis的HSP20基因组序列保存为FASTA格式，用ClustalW软件进行多序列比对，MEGA7.0软件邻接法（Neighbor-Joining Joining）进行系统化树的构建.

1.3 花生HSP 20基因染色体定位分析

从Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）数据库中查找花生HSP20基因位置及各条染色体长度，利用软件MapInspect绘制染色体定位图.

1.4 花生HSP 20基因结构和保守基序预测

从Peanutbase（http:∕∕peanutbase.org∕）数据库下载AdHSP20基因和AiHSP20基因的编码区序列（CDS）和基因组序列，利用在线网站GSDS绘制蛋白结构图.采用MEME（http:∕∕meme-suite.org∕）在线工具对该基因家族的基序（Motif）进行预测，发现基序最多值设置为5，其余不做改动.

1.5 花生HSP 20基因家族表达特性分析

从花生基因组数据库中下载野生种花生RNA-Seq测序的基因表达数据（https:∕∕www.peanutbase.org∕gene_expression）.利用hemI软件将对HSP20基因家族在花生不同组织器官的表达模式进行聚类分析并绘制热图.

1.6 花生HSP 20基因家族上游调控序列分析

在Peanutbase数据库中获得HSP20基因的NCBI编号，将NCBI编号逐一提交到NCBI在线软件中，找出并下载每个基因的上游2 000 bp序列，利用软件plantcare（http:∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕plantcare∕html∕）进行顺式作用元件分析.

2 结果与分析

2.1 花生HSP 20家族基因的鉴定及特性分析

通过HMMER软件搜索花生基因组数据库和进一步的结构域确认，共鉴定出AdHSP20基因和AiHSP20基因各27个.根据染色体定位信息分别命名为AdHSP20-1～AdHSP20-27和AiHSP20-1～AiHSP20-27.在PeanutBase数据库中获得HSP20基因的基本信息，并利用ProtParam分析HSP20蛋白的等电点和分子量，结果如表1和表2所示.AdHSP20基因长度差异很大，最短的是AdHSP20-4（438 bp），最长的是AdHSP20-5（7 896 bp）；其中，13个AdHSP20家族成员的等电点在4.77～6.93，14个AdHSP20家族成员的等电点在7.74～9.74；其分子量为14 194.11～74 147.53 D.AiHSP20基因家族基因长度为946 bp~1 103 bp.AiHSP20蛋白组成大多数为酸性氨基酸，氨基酸长度在110~2 062 Aa之间.其分子量的最小值35 791.87 Da（AiHSP20-8），最大值是1 230 785 Da（AiHSP20-23）.

表1 野生种花生A.duranensis的HSP 20基因信息

表2 野生种花生A.paensis的HSP 20基因信息

2.2 花生HSP 20基因家族进化分析

下载拟南芥HSP20基因序列并和野生花生HSP20基因家族成员进行系统进化分析（图1）.结果可以看出，花生HSP20的基因家族成员与拟南芥HSP20基因同源性程度较高.27个AdHSP20基因家族分为4个亚家族，每个亚家族数量不等.其中20个AdHSP20基因（74.07%）定位在细胞核（C），4个AdHSP20基因（14.81%)定位于线粒体（M），2个AdHSP20基因（7.41%）定位于过氧化物酶体（PO），1个AdHSP20基因（3.70%）定位在质体（P），没有定位在内质网（ER）中的基因.AiHSP20基因家族分为11个亚族，其中内质网（ER）有1个基因，质体（P）有2个基因，线粒体（MII）有1个基因，线粒体（MI）有2个基因，除了细胞核（CII）含有2个基因外，CIII、CVI、CVII分别含有1个基因，而CI有6个基因.

图1 花生HSP 20基因家族系统进化关系分析

2.3 HSP 20基因家族染色体定位分析

分析HSP20基因家族染色体定位信息，绘制染色体定位图（图2）.从图中可以看出，27个AdHSP20基因随机分布在1到9号染色体上，其中，5号染色体上只有1个AdHSP20成员，1、4、9和10号染色体上各有2个AdHSP20成员，2和3号染色体上存在3个AdHSP20成员，8号染色体上有5个成员，7号染色体上分布最多，为7个AdHSP20成员.存在4对串联重复序列（AdHSP20-14∕AdHSP20-15，AdHSP20-14∕AdHSP20-15∕AdHSP20-16，AdHSP20-17∕AdHSP20-18，AdHSP20-19∕AdHSP20-20）.AiHSP20基因家族成员分布在9条染色体的不同位置上.7号染色体包含9个基因，5号染色体包含1个基因，1号和4号染色体包含3个基因，2、6、9和10号染色体各包含2个基因.存在2对串联的重复序列（AiHSP20-21∕AiHSP20-22∕AiHSP20-23，AiHSP20-26∕AiHSP20-27）.

图2 HSP 20基因家族染色体定位分析

2.4 花生HSP 20基因家族结构及保守基序分析

HSP20基因家族的内含子-外显子及其保守基序分析如图3所示.在27个AdHSP20基因中，6个基因不含内含子，15个基因含有1个内含子，其余基因家族成员含有2~10个内含子.AdHSP20基因家族含有的外显子数目差距比较大，只含有1个外显子的基因家族成员有6个，含有2个外显子（CDS）的成员最多，多达15个，6个成员的外显子数在3~11之间.花生AiHSP20基因家族外显子的数量通常为2个，而AiHSP20-8基因仅包含1个外显子；其余基因包含有3至7个；AiHSP20-5和AiHSP20-21基因含有12个外显子；AiHSP20-25为17个.保守基序结果显示，在27个AdHSP20基因家族成员中，除了AdHSP20-14和AdHSP20-23这2个家族成员无Motif外，其他都有1至4个Motif，其中4个AdHSP20家族成员只有1个Motif，12个AdHSP20基因家族成员有2个Motif，7个AdHSP20基因家族成员有3个Motif，2个AdHSP20基因家族成员有4个Motif.Motif1和Motif2存在于大部分AiHSP20基因中，只有AiHSP20-18、AiHSP20-19和AiHSP20-20存在Motif3、Motif4和Motif5；AiHSP20-3、AiHSP20-5、AiHSP20-10只存在Motif1而AiHSP20-4、AiHSP20-14没有基序.从图中还可以看出有21个AdHSP20基因家族成员同时含有Motif1和Motif2，通过对比可以发现，亲缘关系越相近的基因家族成员，其Motif分布的数量和位置也越相同.这些结果表明这27个AdHSP20基因家族成员可能具有相对较高的保守性.

图3 花生HSP 20基因家族结构与进化分析

2.5 花生HSP 20基因家族组织表达特性

以花生野生种22个组织中基因表达数据为基础，提取HSP20基因相关数据，进行组织表达模式分析，结果如图4所示.可以看出，HSP20基因家族在花生的22个组织中表达情况不同.大部分基因在花及种子的不同发育时期表达量低.Aradu.EM2UC，Araip.KV8CW，Araip.SBC75，Aradu.BGMOC，Araip.96WUD，Aradu.VOJK3，Aradu.4G8YD，Aradu.L4J2W，Araip.J4RXP，Aradu.BJ6ZM，Arai p GC3C4，Araip.9ZW22，Aradu.Z42XR，Araip.E6U9Y，Aradu.SJ2KY，Aradu WLIAY在22个组织中表达量低.其中，Araip.WTB7G仅在根中低表达，Aradu.BJ6ZM仅在雌蕊中表达，Araip.IW5F0基因在所有组织中都无表达.2个野生种花生中各有5个基因在22个组中高表达.其中，A.duranensis中高表达基因为AdHSP20-7（Aradu.XVU7P），AdHSP20-8（Aradu.XQ3RE），AdHSP20-17（Aradu.RYN4L），AdHSP20-20（Aradu.WH8HR），AdHSP20-24（Aradu.65PX4）；A.ipaensis中在各组织表达量较高的基因分别为AiHSP20-6（Araip.PRK60），AiHSP20-7（Araip.E15FG），AiHSP20-15（Araip.VGJ9R），AiHSP20-16（Araip.T9454），AiHSP20-25（Araip.KY2NA）.

图4 HSP 20基因家族的组织表达情况分析

2.6 花生HSP 20基因家族成员上游调控序列分析

研究分别对27个AdHSP20和AiHSP20基因的启动子区进行检索，查找其存在的参与胁迫基因的顺式作用元件，结果如表3和表4所示.由表中可以看出，不同HSP20基因家族成员的顺式作用元件种类和数目存在差异.主要有激素应答元件和逆境胁迫应答元件这2大类.激素应答元件有ABA应答元件（ABRE）、生长素应答元件（AuxRR-cor∕TGA-element）、乙烯应答元件（ERE）、赤霉素应答元件（GARE-motif∕P-box∕TATC-box）、水杨酸应答元件（TCA-element）和茉莉酸甲酯应答元件（CGTCA-motif∕TGACG-motif）这6种.其中，22个AdHSP20因含有ABA应答元件，17个AdHSP20基因含有1至4个生长素顺式作用元件.逆境胁迫应答有LTR（低温胁迫应答元件）、MBS（干旱胁迫应答元件，WUN motif（伤害应答元件）和TC-rich repeats（防御与胁迫应答元件）这4种.其中，13个AdHSP20基因家族成员含有低温胁迫应答元件和干旱胁迫应答元件，7个AiHSP20基因具有低温胁迫元件（LTR），20个AiHSP20基因具有干旱胁迫应答元件（MBS），其中AiHSP20-4含有最多MBS元件（3个）；7个AiHSP20基因具有WUN-motif（7个），12个AiHSP20基因具有TC-rich repeats，其中AiHSP20-2含有2个.说明HSP20在花生生长发育及响应逆境胁迫中起到了重要作用.

表3 AdHSP 20基因启动子区顺式作用元件种类及个数

表4 AiHSP 20基因家族启动子区顺式作用元件分析

3 讨论

HSP20是一类广泛存在于植物中的小分子热激蛋白，在植物受到不良环境，比如低温、高温、干旱、盐、氧化等胁迫后迅速大量合成.野生花生具有较强的抗逆性和抗病性，但其HSP20基因家族分析还未见报道.本研究利用生物信息学方法对2个野生种花生HSP20基因家族进行挖掘鉴定，发现2个野生种各有27个HSP20基因家族成员.比拟南芥（19个），白菜（27个），辣椒（35个）中的基因家族成员多[3-5].花生HSP20蛋白多数为酸性氨基酸，与坛紫菜HSP20蛋白的分析结果一致[12].这些基因多数定位于细胞核或者细胞质中，定位于内质网、线粒体、质体、过氧化物酶体的HSP20基因成员只有少数，这与张宁等人[8]对番茄HSP20基因家族成员分析结果一致.Scharf等[3]对拟南芥19个HSP20基因家族成员的研究表明，定位在细胞核或细胞质中的基因有13个，定位于内质网、线粒体、质体、过氧化物酶体的基因有6个；Sarkar等[13]对水稻的23个HSP20基因家族成员的分析表明，分布在细胞核或者细胞质中的有16个基因，定位于内质网、线粒体、质体、过氧化物酶体的有7个基因.说明HSP20家族基因间存在多样性，这为进一步深入研究HSP20基因功能提供了理论基础.

本研究对野生种花生HSP20基因结构，基因位置，系统发育关系和保守基序研究结果显示，基因结构不同，内含子个数多数为0到1个，且长度比较短.这与Mattick等[14]研究的植物倾向于保留无内含子或者长度较短的内含子基因一致.何福林等人[15]研究表明，银杏HSP20基因的每个亚家族中成员均具有相似的分布特征.同时，对其染色体分布研究表明，花生中HSP20基因家族存在着多对串联重复序列.亲缘关系越相近的HSP20基因家族成员，其Motif分布的数量和位置也越相同.这些结果表明该基因家族在进化进程中高度保守.

多种生物及非生物（高温、低温、干旱）胁迫能够诱导HSP20基因上调表达，其启动子上游调控序列对其表达水平发挥着重要作用[16-17].花生在不同生长发育阶段受干旱等逆境胁迫，影响着花生的品质和产量.本研究在对HSP20基因启动子顺式作用元件分析结果表明，其存在逆境胁迫应答元件，大多数HSP20基因家族成员含有低温、干旱胁迫应答元件、伤害应答元件与防御与胁迫应答元件.初步推测该基因参与花生抵抗低温胁迫和干旱胁迫反应.邓立新等人[18]克隆双孢蘑菇的HSP20基因并在拟南芥中表达，结果显示，HSP20基因的表达增加了拟南芥的耐热性.周亚东等人[19]研究表明，番茄HSP20基因受高温胁迫表达量增加.另外，该基因还存在着大量的激素应答元件，表明其参与植物生长发育过程的调控.对该基因家族的组织表达特性分析结果也表明，HSP20基因家族具有组织表达特异性，且大部分基因在花生果针入土后开始大量表达.推测这些基因参与植物细胞内的一系列信号转导和代谢过程，对调控花生生长过程发育起着重要作用.此外，每个基因具有多个响应元件，这说明花生中的HSP20基因家族的每个成员同时参与多个信号通路，因此下一步的主要任务是对HSP20基因的表达和调控差异及其调控机理的研究.

4 结论

HSP20是一类广泛存在于植物中的小分子热激蛋白，以基因家族的形式存在，在植物受到逆境胁迫后迅速大量合成.本研究利用生物信息学方法对花生全基因组序列挖掘，共鉴定出54个HSP20基因家族成员，进一步分析其理化性质、基因结构、系统进化关系、染色体定位和表达特性，可初步推测出该基因家族在花生抵抗非生物胁迫（低温胁迫、干旱胁迫等）及植物生长发育过程中发挥着重要的作用，为将来深入研究花生HSP20功能奠定了基础.