罗 优，肖 洋，周庭宇，王 越，谢 宸，李冬莹，陈雪丽

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨 150086）

0 引言

盐碱生境是指表层盐碱集聚，是盐土和碱土以及各种盐化、碱化土壤的总称，由一种或几种盐渍土组成[1]。中国盐碱生境面积较广，类型多样，主要分布在西北、华北、西部、华东和东北等地区[2]。DNA测序技术的进步以及多相分类方法的发展，为大量的盐碱土壤放线菌的挖掘与分类提供了客观可靠的手段。许多研究表明，已从盐碱土壤环境中分离出大量放线菌，其对极端条件有特殊适应机制且在生物技术方面具有很大的潜力[3]，如抗生素、杀菌剂和抗病毒等[4]。但社会经济的快速发展导致盐碱生境持续恶化，盐碱生境极端放线菌资源的挖掘与多样性保护刻不容缓。

因此，充分了解盐碱土壤放线菌的资源分布，包括其多样性和新物种资源，进一步分析归纳具有针对性的分离筛选技术，是盐碱土壤放线菌挖掘和多样性保护的重要前提。

1 盐碱土壤放线菌的资源分布与新物种资源

随着微生物系统学的不断发展，越来越多的微生物物种资源被人们所发掘；但目前所发现的盐碱土壤放线菌资源只是自然界中物种数量的极少数，还有很多的未知盐碱土壤放线菌资源未被发掘。而充分认识盐碱土壤放线菌的资源分布情况，包括其多样性和新物种资源，是挖掘盐碱土壤放线菌资源的坚实基础。

1.1 盐碱土壤放线菌的地理分布

在中国，盐碱土壤的分布区域非常广泛，主要是分布在秦岭淮河以北，大致可划分为滨海盐渍区、东北盐渍区、黄淮海盐渍区、甘新青盐渍区[5]。其气候区分布特点多种多样，囊括了湿润区、半湿润区、半干旱区、干旱区、半漠境区、漠境区等，因此也造就了盐碱土壤中嗜盐耐碱放线菌资源的多样性。其中，甘新青盐渍区是中国盐碱土壤可培养放线菌资源研究最多的区域。潘媛媛等[6]在东北盐渍区中的松嫩平原的盐碱地耐盐菌生物多样性的研究中，纯培养放线菌占比达到17.5%，其主要的分类群为库克菌属(Kocuria)、乔治菌属(Georgenia)、刘志恒菌属(Zhihengliuella)。且研究者对中国盐碱生境中放线菌资源有极大兴趣，因而放线菌资源纯培养的调查研究也逐年增加。

1.2 盐碱土壤放线菌的多样性

目前，在中国，主要是在西北、华北、西部、华东和东北等地区进行盐碱土壤放线菌资源的调查研究，且各地区差异显著。

1.2.1 西北地区 地区盐碱土壤放线菌资源调查研究主要分布在新疆、内蒙古和青海。盐碱土由于独特的地理位置和干旱的气候，广泛分布于中国西北部的新疆，因此新疆成为中国盐碱土壤放线菌资源研究的热点区域，也是报道最多的[7]。新疆地区占主导地位的放线菌类群为放线多孢菌科(Actinopolysporaceae)[7-9]、糖霉菌科 (Glycomycetaceae)[10-11]、姜氏菌科(Jiangellaceae)[12]、博戈里亚湖菌科(Bogoriellaceae)[13]、短杆菌科(Brevibacteriaceae)[14-15]、微球菌科(Micrococcaceae)[16-18]、原小单孢菌科(Promicromonosporaceae)[19]、阮氏菌科(Ruaniaceae)[20]、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)[21]、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)[22-24]、链霉菌科(Streptomycetaceae)[25-26]、拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)[27-28]、生地所球菌科(Egicoccaceae)[29]。诺卡氏菌科的大多数成员都从盐水或碱性环境中分离，能采用复杂的菌丝分化来适应这些极端环境，从而获得形成一些生物活性产物的能力[27]。利用纯培养分离筛选技术对青海省土壤微生物群落多样性的研究中，共分离到7个属，包括微杆菌属(Microbacterium)[30]、Yaniella[18]、刘志恒氏菌属(Zhihengliuella)[31]、产丝菌属(Myceligenerans)[32]、栖白蚁菌属(Isoptericola)[33]、链霉菌属(Streptomyces)[34-35]、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)[36-37]。研究表明，嗜碱放线菌可以产生多种碱性酶和生物活性物质，如抗生素和酶抑制剂，在碱性环境中生长的嗜碱放线菌具有典型的营养需求、培养条件和生理特性[34]。目前，对内蒙古盐碱土壤放线菌的研究较少，只在位于内蒙古自治区采集的盐碱土壤样品中分离到Phytoactinopolyspora属的一种新的中度嗜盐菌[38]。

1.2.2 华北地区 该地区盐碱土壤放线菌资源调查研究以河北省为主，都是从盐碱地碱蓬的根际土壤分离出来。纯培养结果表明，河北省盐碱土壤可培养放线菌类群主要为Salilacibacter、Planctomonas、Hoyosella[39-41]。其次，山西省盐碱土壤可培养放线菌类群，主要为原小单孢菌科(Promicromonosporaceae)[42]。

1.2.3 西部地区 研究表明，西部地区盐碱土壤可培养放线菌的分类群以拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)为主[43]，包括琼斯菌属(Jonesia)[44]。拟诺卡氏菌属的成员在盐渍土或碱性土壤中占优势，已从中分离出较多新物种[43]。

1.2.4 华东地区 山东省东营胜利油田被原油污染的盐碱土里面蕴含着较为丰富的可培养盐碱土壤放线菌资源，主要的分类群为Hoyosella[45]、四球菌属(Tessaracoccus)[46]。而在山东省德州市陵县的盐碱土壤可培养放线菌资源的调查研究中，纯培养结果表明，该地的主要分类群为冷杆菌属(Frigoribacterium)[47]。中国对滨海盐渍区放线菌资源的研究较少，一些学者[48]从江苏省连云港沿海地区采集的盐渍土壤中分离得到一株放线菌，分类群是诺卡菌属(Nocardia)，该属的大多数物种是从土壤样品中分离出来的。

1.2.5 东北地区 潘媛媛等[49]对松嫩平原盐碱土壤中耐盐和嗜盐细菌的微生物多样性和分类进行研究，纯培养结果表明该地嗜盐耐碱放线菌资源丰富，考克氏菌属(Kocuria)占优势。链霉菌属(Streptomyces)[50-51]在黑龙江地区盐碱土壤可培养放线菌资源中占主导地位。链霉菌属的成员因具有产生多种次生代谢物的能力而被广泛关注，包括产生抗菌和抗肿瘤活性的化合物[50]。

1.2.6 西南地区 云南省玉溪市元江县中存在着大量的可培养放线菌资源，动孢菌科(Kineosporiaceae)[52]在其中占绝对优势，其次是假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)[53]。

综上所述，盐碱生境中蕴藏着的放线菌资源较为丰富，其中主要以微球菌科(Micrococcaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)占主导地位。但盐碱土壤中还有大量的放线菌物种等着人们去挖掘和进行多样性保护。

1.3 盐碱土壤放线菌的新物种资源分类

了解从盐碱生境通过纯培养分离出来的放线菌新物种情况，对相关生境放线菌资源的挖掘与多样性的保护具有重要理论价值。由于从常见物种中寻找新的药物化合物变得更加困难，许多研究者已转向来自不寻常和未被探索的一些极端生境中挖掘放线菌资源，如盐渍土[50]。经总结，从2000年至今在中盐碱生境中已有96株放线菌新物种被报道，分别属于2个纲、11个目、18个科和40个属。其中，拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)占主导地位，有13个放线菌新物种；其次是链霉菌属(Streptomyces)、糖霉菌属(Glycomyces)和链单孢菌属(Streptomonospora)占比较高，分别是11、6、5个放线菌新物种；放线多孢菌属(Actinopolyspora)、Phytoactinopolyspora、涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora)，都是4个放线菌新物种等。特别明显的是，西北地区是这些放线菌新物种资源的主要来源地区，其中新疆地区是放线菌新物种资源最多的地区，其次是青海地区、西部地区和云南地区（图1）。2000—2021年盐碱土壤放线菌新物种数量呈现出较为稳定的起伏增长趋势，在2016年激增达到最高数量的新物种（图2）。

图1 2000—2021年已发表盐碱土壤放线菌新物种样品来源地

图2 2000—2021年已发表盐碱土壤放线菌新物种数

2 盐碱土壤放线菌的分离培养方法

盐碱土壤中放线菌的最适分离培养方法包括土壤前处理、抑制剂选择、培养基的选择、培养基盐碱的添加以及培养温度与时间的选择，可以提高盐碱土中嗜盐碱放线菌的筛选效率，以期能为今后盐碱土放线菌资源的开发和利用奠定基础。

2.1 土样预处理

为了使得放线菌，尤其是目的放线菌的数量大量增加，可以对土壤样品进行预处理，这样减少了真菌以及非放线菌型细菌的数量。研究表明，土壤样品加入到含有10%氯化钠的无菌水中，再通过涡旋混合，能增加放线菌的出菌率[54]。也有研究证明，土壤样品在28℃环境下自然风干7天，然后将自然风干的土壤样品80℃干热处理1 h，一些常见细菌与真菌数量明显减少，有助于动球菌属(Kineococcus)、普氏菌属(Prauserella)等类群的分离[52-53]。研究者采用将土壤样品在振荡培养箱中于28℃孵育2～3天的预处理方法，从黑龙江省肇东市德昌乡的盐碱土壤中分离培养到一株考克氏菌属(Kocuria)的新物种[49]。将土壤样品(5 g)悬浮在蒸馏水(2 mL)中，进行超声处理(160 W)3 min，再加入蒸馏水(43 mL)、3%酵母提取物(w/v，1 mL)和2.5% SDS(w/v，1 mL)，超声处理有利于放线菌细胞和孢子从土壤中脱落，从而提高其放线菌的出菌率[50]。

2.2 培养基设计

培养基的设计对于放线菌的分离筛选是至关重要的，包括培养基种类、pH与盐浓度的调节以及抑制剂的选择。

2.2.1 培养基 许多研究表明，ISP系列培养基(ISP2、ISP4、ISP5)对于放线菌类群有较高的选择性，包括涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)和链单孢菌属(Streptomonospora)，尤其是拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)[27,34]。而starchcasein agar培养基则对动球菌属(Kineococcus)、普氏菌属(Prauserella)和链单孢菌属(Streptomonospora)等放线菌类群有较强的选择性[23,28,52]。腐植酸和不同浓度的vitamin agar培养基是分离筛选稀有嗜盐放线菌的最佳基质，腐植酸通过阻止培养基中可扩散色素的产生，加强了放线菌的形态特征[55]。此外，除了以上ISP系列培养基和starch-casein agar培养基外，CCMS、GW1、SSC、SM3、GTY、chitin-asparagine和CMKA等培养基也是分离盐碱土壤放线菌比较常用的培养基[8,10,13]。

2.2.2 pH的影响 碱是盐碱土壤中的不可或缺的因素，因此在进行分离培养基设计的时候，其培养基的pH应进行调节。分离培养盐碱土壤放线菌时常用Na2CO3、NaOH、KOH和K2CO3来调节pH[34]。大量研究表明，较多盐碱土壤放线菌在分离培养在pH 7.0～7.5时能被分离筛选出来[11,23,28]。一些学者将培养基调节为pH 10～10.5，有助于栖白蚁菌属(Isoptericola)[33]、链霉菌属(Streptomyces)[34]、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)[27]和生地所球菌属(Egicoccus)[29]等放线菌类群的选择性分离。

2.2.3 盐浓度的影响 盐是盐碱土壤中另一不可或缺的因素，因此调节培养基的盐浓度对于有选择性地分离放线菌是十分重要的。常用NaCl、CaSO4和KCl来进行培养基盐浓度的调节，而大量盐碱土壤放线菌是在培养基盐浓度为5%～15%时被分离出来[28,42-43]。研究表明，培养基盐浓度高达20%时，有助于Yaniella[18]、普氏菌属(Prauserella)[23]、链霉菌属(Streptomyces)[35]和拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)[56]等放线菌类群的分离。

2.2.4 抑制剂的选择 一些特定的抑制剂的使用有利于抑制非放线菌型细菌和真菌的生长，使得目的放线菌的数量显著增加[55]。放线菌酮(cycloheximide)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、制霉菌素(nystatin)和重铬酸钾(potassium dichromate)是盐碱土壤放线菌分离过程中常用的抑制剂。研究表明，在培养基中添加放线菌酮(50 mg/L)以及萘啶酮酸(20 mg/L)主要的分离物种为链霉菌属(Streptomyces)[50-51]。此外，一些学者研究发现重铬酸钾(70 mg/L)能有选择性地分离到动球菌属(Kineococcus)[52]。

2.3 培养温度与时间

截至目前，大量的已发表盐碱土壤放线菌，培养温度范围在28～37℃，培养温度为28℃时分离的放线菌物种最多[18,23,26]，其次是37、30、32、35℃。值得注意的是，盐碱土壤放线菌的培养时间范围长达5周，大部分放线菌在培养2周时生长，但也有一部分生长较为缓慢，长达5周[41]，因此在进行盐碱土壤放线菌的分离培养时，适当的延长培养时间能够分离到一些稀有的新物种。

3 展望

盐碱土壤放线菌因具有适应极端环境条件的独特性，在生物科技创新领域占据着重要地位。且随着纯培养技术以及现代测序技术的进一步发展与成熟，越来越多的盐碱土壤放线菌新物种及其功能基因被挖掘和开发。值得注意的是，由于目前人们并没有充分掌握最适盐碱土壤放线菌自然状态的预处理、培养基和培养条件，这些基于人工条件挖掘出来的盐碱土壤放线菌只是自然界微生物的极少部分。

深入了解盐碱土壤放线菌的资源分布、新物种资源和多样性，有利于系统保护并充分利用其基因资源，而分析归纳盐碱土壤放线菌的分离培养技术，则为充分挖掘新物种资源奠定基础。目前，纯培养技术与免培养技术相结合，更有助于更全面的挖掘与分析盐碱土壤的放线菌物种多样性，以此来丰富微生物资源库，也为生物技术创新提供特殊的材料支持。