王梦琪，陈文婷，程金生，敬思群*，钟瑞敏，李发利，于白音

（1.韶关学院英东食品学院，广东 韶关 512005；2.喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844006；3.韶关市曲江区竹园火山粉葛专业合作社，广东 韶关 512005）

葛根（Puerariae Lobatae Radix，RLP）为豆科植物的干燥根[1]，分为粉葛和野葛根两大类。葛根资源十分丰富，分布极其广泛，在我国它主要分布在温暖潮湿、土质深厚、富含砂质土壤的江南地域[2]。葛根是一种药食同源的植物，始记于《神农本草经》，具有较高的营养保健功效和药用价值。葛根性甘、辛、凉，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻之功[3]。其主要的活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物[4]，葛根对心脑血管、免疫系统疾病有很好的治疗效果[5]。葛根茶作为一项新兴的葛根制品具有很大的市场潜力[6-8]。黄维安等[9]以菊苣、葛根、甜茶、五指毛桃、橘皮等药食同源的中药材为原料，经清洗、干燥、粉碎、包装等工艺制成菊苣葛根袋泡茶；雷成群等[10]经发酵除淀粉、烘炒提香、烘干等工艺制得粉状葛根茶；王润东等[11]利用提取完淀粉后的葛根纤维渣，采用固定化细胞技术制得红茶菌发酵葛根茶饮料。野葛根直接冲泡时，具有浓郁的中药气味以及苦味，饮后口感粗糙苦涩。通过预试验发现，搭配枸杞、杭白菊冲泡后不仅能凸显野葛根较浓郁的特征风味，还保留了杭白菊、枸杞子的酸甜清香的口感。目前，关于葛根茶抗氧化作用研究鲜见报道。

本研究以异黄酮含量、感官评价为考察指标，研究配料比（葛根∶枸杞子∶杭白菊）、冲泡时间、冲泡温度和用水量对葛根袋泡茶（Puerariae Lobatae Radix tea bag，PLRTB）品质的影响，采用综合评分法，通过均匀设计优化葛根袋泡茶配方和沏茶工艺参数，同时分析了葛根袋泡茶的抗氧化性及挥发性成分，为葛根袋泡茶产业化生产提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

野葛根粒：韶关学院英东食品学院功能食品研究室自制。将野葛根粒清理除杂，用中药铡刀切成1 cm×0.5 cm小段，过14目筛除去筛下物，在60℃烘箱烘干7 h～8 h，真空干燥器中保存。野葛根：韶关市曲江区大塘镇竹园火山粉葛专业合作社；杭白菊（食品级）：宁国市艺然食品商贸有限公司；枸杞子（食品级）：宁夏果果老爹食品有限公司。

葛根素（色谱纯，纯度≥99.9%）：上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸（VC）（优级纯，纯度≥99.7%）：西陇科学股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯，纯度＞97%）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二 胺 盐 [2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（分析纯，纯度＞98%）：上海源叶生物科技有限公司；过硫酸钾（K2S2O8）、氯化钾、铁氰化钾[K3Fe（CN）6]（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.1.2 仪器与设备

BSM-220.4分析天平：上海卓精电子科技有限公司；KD0281中药铡刀：广东膳道厨具有限责任公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州越新仪器制造有限公司；DHG-9146电热恒温鼓风干燥箱：金坛市大地自动化仪器厂；UV-2600紫外分光光度计、GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪：岛津企业管理（中国）有限公司；TD-5Z台式低速多管架离心机：四川蜀科仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根袋泡茶制备工艺单因素试验

1.2.1.1 原辅料配方单因素试验

以野葛根为原料，枸杞子、杭白菊为辅料，按照以下配比制成袋泡茶（总质量为2.00 g），以感官评分、异黄酮含量为考察指标，采用综合评分法确定最适的原辅料配方。原辅料比是葛根∶辅料（杭白菊∶枸杞子）（g/g），辅料比为杭白菊∶枸杞子（g/g）。

1）原辅料比对葛根袋泡茶品质的影响：在辅料比为1∶1（g/g）时，用 100℃100 mL 水冲泡 8 min，原辅料比分别为 1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、4∶1（g/g），确定最适原辅料配比。

2）辅料比（杭白菊∶枸杞子）对葛根袋泡茶品质的影响：在原辅料比为 2∶1（g/g）时，用 100 ℃ 100 mL 水冲泡 8 min，辅料比（杭白菊∶枸杞子）分别为 1∶6、2∶5、1∶1、5∶2、6∶1（g/g），确定最适辅料配比。

1.2.1.2 葛根袋泡茶沏茶工艺单因素试验

以野葛根为原料，枸杞子、杭白菊花为辅料，按照原辅料比为 2∶1（g/g），辅料比为 1∶1（g/g）的配比制成袋泡茶（总重为2.00 g），以感官评分、异黄酮含量为考察指标，采用综合评分法确定最适的单因素水平。

1）冲泡时间对葛根袋泡茶品质的影响：用100℃100 mL 水进行冲泡，分别冲泡 4、6、8、10、12 min，确定最适冲泡时间。

2）用水量对葛根袋泡茶品质的影响：用100℃的水冲泡 10 min，分别加入 50、100、150、200、250 mL 水进行冲泡，确定最适用水量。

3）冲泡温度对葛根袋泡茶品质的影响：用100 mL水冲泡 10 min，分别用 40、55、70、85、100 ℃进行冲泡，确定最适冲泡温度。

1.2.2 葛根袋泡茶制备工艺均匀设计试验

通过单因素试验，得最适配比及其沏茶工艺后，为优化袋泡茶方案，选取5个试验因素：原辅料比（X1）、辅料比（X2）、冲泡时间（X3）、冲泡温度（X4）、用水量（X5），每个因素设置 5 个水平，以异黄酮含量（W1）和感官评分（W2）为试验指标，综合评分使用因变量W表示，其综合评分越高，各试验因素组合效果越好。根据均匀设计基本原理，采用均匀设计U10（1010）优化葛根袋泡茶配方，设计表见表1。

表1 U10（1010）均匀设计试验因素水平Table 1Factors and levels of U10（1010）uniform design

1.2.3 葛根袋泡茶品质的评价方法

1.2.3.1 感官评定标准

从袋泡茶的外形、汤色、香气、滋味、叶底5方面评定袋泡茶的质量，由8位具有一定专业知识的技术人员根据袋泡茶的感官质量指标进行评分。参考国标GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》[12]制定评价标准，见表2。

表2 葛根袋泡茶感官评分标准Table 2 Sensory scoring criteria of PLRTB

1.2.3.2 异黄酮含量测定

异黄酮含量测定方法参考地方标准DB32/T 1277—2008《葛根中异黄酮含量的测定紫外分光光度法》[13]，稍有改动。得到吸光度与葛根素浓度的回归方程为y=74.536x+0.011 5，相关系数R2=0.999 6，在0～0.012 mg/mL范围内呈良好的线性相关。

样品异黄酮含量测定：移取100 μL在一定冲泡温度、冲泡时间、用水量下制得的茶液，以70%乙醇定容到10 mL容量瓶中，于250 nm处测定样品吸光度，以70%乙醇为参比溶液，根据标准曲线计算得出试样中异黄酮含量。计算公式如下。

式中：C为回归方程中求出的葛根素含量，mg/mL；V1为试样溶液体积，mL；V2为茶汤体积，mL。

1.2.3.3 综合评分法

本试验以异黄酮含量、感官评分作为考察指标，采用综合评分法可将两者有效结合。异黄酮含量和感官评分的权重系数各为0.5。

按此方法进行加权求和，综合评分计算公式如下。

式中：W为综合评分；W1为异黄酮含量的数值；W1max为各组的异黄酮含量对应的最大值；W2为感官评分。

1.2.4 体外抗氧化活性评价

1.2.4.1 样液制备

取5袋葛根袋泡茶（每袋含葛根、枸杞子、杭白菊质量分别为 1.33、0.40、0.27 g，内容物共 10.00 g），捣碎，加入100mL冷凝水，65℃水浴提取5h，离心后取上清液，在0.08 MPa、80℃条件下旋蒸2 h，得浓度为0.1 g/mL的袋泡茶提取液。再将袋泡茶提取液用去离子水稀释为 5 个梯度浓度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，备用。

1.2.4.2 抗坏血酸（VC）溶液制备

准确称取0.25 g抗坏血酸（VC），溶解并定容于25 mL容量瓶中，制得10 mg/mL的抗坏血酸对照品溶液，再将其稀释为 5 个梯度浓度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，备用。

1.2.4.3 抗氧化活性分析

以清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力、总抗氧化能力为体外抗氧化能力评价指标，以抗坏血酸为对照。以IC50值表示清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力，IC50值表示样品提取液抑制DPPH（或ABTS+）自由基的吸光度为50%时提取物的浓度，IC50值越小，表示抗氧化能力越强。制备葛根袋泡茶提取液，以它们的抗氧化性来反映袋泡茶的抗氧化活性。

DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及总抗氧化能力的测定参考周扬等[14]的方法。

DPPH自由基清除能力测定采用紫外分光光度计于波长517 nm处分别测定3 mL蒸馏水与3 mL DPPH乙醇混合溶液、3 mL样品液与3 mL DPPH乙醇混合液、3 mL样品液与3 mL无水乙醇混合液的吸光度A0、A1、A2。以抗坏血酸为阳性对照组。DPPH自由基清除率计算公式：DPPH 自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100。

ABTS+自由基清除能力是采用紫外分光光度计于波长734 nm处分别测定0.2 mL蒸馏水与4 mL ABTS溶液、0.2 mL样品液与4 mL ABTS溶液、0.2 mL样品液与4 mL蒸馏水混合溶液反应后的吸光度A0、A1、A2。ABTS+自由基的清除率计算公式：清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100。

总抗氧化能力的测定：取1 mL样品液与2.5 mL磷酸盐缓冲液（pH6.6）、2.5 mL1%铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴反应20 min，随后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，吸取2.5 mL，加入蒸馏水和0.1%FeCl3溶液各2.5 mL，混匀，室温下静置10 min，700 nm处测定吸光度A。以蒸馏水作空白对照测吸光度A0，以抗坏血酸为阳性对照。总抗氧化能力（WA）计算公式：WA=A-A0。

1.2.5 葛根袋泡茶挥发性成分分析

采用顶空-固态微萃取-气相色谱-质谱联用法（headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析袋泡茶风味成分，参照雷丹等[15]的方法，稍有修改。

样品处理：称取葛根袋泡茶样品2 g，制得茶汤，准确吸取（3.5±0.01）mL茶汤于15 mL顶空瓶中，置于65℃恒温水浴中平衡10 min，使葛根茶样品挥发性物质充分释放；用DVB-CAR-PDMS萃取头顶空萃取40 min（萃取前于250℃活化15 min），然后置于250℃进样口解吸5 min。

气相色谱-质谱分析条件：分流比1∶1；载气为高纯氦气；流速1.0 mL/min；进样口温度250℃。

气相色谱（gas chromatography，GC）升温程序：起始温度40℃，保持时间2 min，以3℃/min的速率升温至120℃保持2 min，再以10℃/min的速率升温至230℃，保持5 min。

质谱（mass spectrometry，MS）条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度 230 ℃，电子能力 70 eV，接口温度250℃，扫描范围40.00 amu～500.00 amu。根据得到的总离子流图谱中各色谱峰的质谱信息，与质谱库进行对比，确定各个色谱峰对应的物质。各色谱峰面积与总峰面积之比为各组分的相对含量。

1.3 数据统计与分析

所有试验重复3次，试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 22.0软件和Microsoft office Excel 2016软件对数据进行分析，采用Prism 6.0作图。

2 结果与分析

2.1 葛根袋泡茶配方单因素试验结果

原辅料比和辅料比对葛根袋泡茶品质的影响见图1、图2。

图1 原辅料比对葛根袋泡茶品质的影响Fig.1 Effect of raw material-to-auxiliary material ratio on quality of PLRTB

图2 辅料比对葛根袋泡茶品质的影响Fig.2 Effect of chrysanthemum-to-wolfberry fruit ratio on quality of PLRTB

由图1可知，原辅料比为3∶2（g/g）时感官评分达到最高值，原辅料比为2∶1（g/g）时异黄酮含量、综合评分最高，综合考虑确定最适原辅料比为2∶1（g/g）。

由图2可知，辅料比为2∶5时异黄酮含量最高；辅料比为1∶1（g/g）时感官评分、综合评分最高，综合考虑确定最适辅料比为 1∶1（g/g）。

2.2 葛根袋泡茶沏茶工艺单因素试验结果

冲泡时间、用水量、冲泡温度对葛根袋泡茶品质的影响见图3～图5。

图3 冲泡时间对葛根袋泡茶品质的影响Fig.3 Effect of brewing time on quality of PLRTB

图4 用水量对葛根袋泡茶品质的影响Fig.4 Effect of water amount on quality of PLRTB

图5 冲泡温度对葛根袋泡茶品质的影响Fig.5 Effect of brewing temperature on quality of PLRTB

由图3可知，葛根袋泡茶的感官评分、综合评分在冲泡时间为8 min时达到最高值，之后随冲泡时间的延长感官评分下降，综合评分基本不变，异黄酮含量持续升高，综合考虑确定最适冲泡时间为10 min。

由图4可知，当用水量为100 mL时感官评分最高，当用水量为50 mL时综合评分最高，异黄酮含量随用水量增加呈下降趋势，用水量为50 mL时袋泡茶口感差，综合考虑确定最佳用水量为100 mL。

由图5可知，随着冲泡温度的升高，感官评分逐渐增长并在100℃时达到最高分；当冲泡温度为55℃～70℃时，异黄酮含量急剧升高并达到顶峰，高于70℃后平缓下降；冲泡温度为70℃综合评分最高，综合考虑确定最适冲泡温度为70℃。

以上单因素试验结果显示，葛根袋泡茶最适配比分别为原辅料比 2∶1（g/g）、辅料比 1∶1（g/g）；最适沏茶工艺分别为冲泡时间10 min、用水量100 mL、冲泡温度70℃。

2.3 葛根袋泡茶工艺U10（1010）均匀设计试验结果

葛根袋泡茶工艺U10（1010）均匀设计试验结果见表3。

表3 U10（1010）均匀设计试验结果Table 3Results of U10（1010）uniform design test

由表3对试验结果的直接分析，得出第8号试验的综合评分W最高（91.07分）。

根据均匀设计试验结果显示，葛根袋泡茶最佳配比分别为原辅料比 2.00∶1（g/g）、辅料比 1.50∶1（g/g）；最佳沏茶工艺分别为冲泡时间9min、料水比为1∶25（g/mL）（袋内容物总重为2 g，用水量50 mL）、冲泡温度65℃。在此条件下进行验证试验，制备的葛根袋泡茶的综合评分为91.25分，异黄酮含量为1.03 mg/mL。

2.4 袋泡茶的体外抗氧化性及风味成分分析

2.4.1 体外抗氧化性

葛根袋泡茶体外抗氧化能力见图6。

图6 葛根袋泡茶体外抗氧化能力Fig.6 In vitro antioxidant capacity of PLRTB

由图6可知，葛根袋泡茶的DPPH、ABTS+自由基清除率和总抗氧化能力皆随浓度增加而增加，且呈剂量效应关系。葛根袋泡茶提取液与抗坏血酸（VC）清除ABTS+自由基的 IC50值分别为（1.136±0.010）、（1.228±0.011）mg/mL；清除DPPH自由基的IC50值分别为（0.307±0.005）、（0.060±0.003）mg/mL；袋泡茶提取液浓度为2.5 mg/mL时，袋泡茶与抗坏血酸（VC）的总抗氧化能力（吸光度）分别为0.319、0.205，袋泡茶的总抗氧化能力强于抗坏血酸。葛根袋泡茶有较强的抗氧化能力。

2.4.2 葛根袋泡茶挥发性成分

葛根袋泡茶的GC-MS总离子流色谱图见图7，葛根袋泡茶的主要挥发性成分及相对含量见表4。

图7 葛根袋泡茶的GC-MS总离子流色谱图Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of PLRTB

表4 葛根袋泡茶的主要挥发性成分及相对含量Table 4 Main volatile components of PLRTB and their relative content

续表4 葛根袋泡茶的主要挥发性成分及相对含量Continue table 4 Main volatile components of PLRTB and their relative content

由表4可知，葛根袋泡茶的挥发性成分有35种，含量位于前列的依次为酯类2种（27.86%）、烯烃类10种（24.6%）、醇类9种（13.99%）、酮类4种（6.01%）、其他类10种（28.17%），单体挥发性成分含量较高的分别是左旋乙酸冰片酯（16.15%）、（Z）-乙酸菊酯（11.71%）、3，3-二甲基-6-亚甲基-环己烯（8.82%）、α-泛酸酶（7.56%）、左旋龙脑（7.06%），左旋乙酸冰片酯具有森林的新鲜香气，左旋龙脑具有清香气，初步推测左旋乙酸冰片酯、（Z）-乙酸菊酯、左旋龙脑是葛根袋泡茶的主要特征风味成分。

3 结论

葛根袋泡茶的最优配方和最优冲泡参数：原辅料比（葛根∶杭白菊+枸杞子）为 2∶1（g/g），辅料比（杭白菊∶枸杞子）为 1.5∶1（g/g），冲泡时间 9 min，冲泡温度65℃，冲泡料水比为1∶25（g/mL）。在此条件下制备的葛根袋泡茶的综合评分为91.25分，异黄酮含量为1.03 mg/mL。葛根茶有较强的抗氧化能力。左旋乙酸冰片酯、（Z）-乙酸菊酯、左旋龙脑是葛根袋泡茶的主要特征风味成分。