李楚忠 郑丽琼 龚盛昭

广州环亚化妆品科技股份有限公司,广东广州，510663

我国女性历来崇尚“肤如雪、凝如脂”，民间更有“一白遮百丑”的说法，东方女性素来有非常重的美白情节，谁都想拥有水嫩、白皙和通透的迷人肌肤。保湿是一切护肤步骤的基础，美白保湿类化妆品占据了整个化妆品市场份额的一半以上，具有皮肤美白、保湿等功能的化妆品是时下亚洲最畅销的化妆品之一。

近年来，市场上出现了越来越多的皮肤美白剂，如曲酸、熊果苷和壬二酸等，它们作为酪氨酸酶抑制剂而广泛用于美白化妆品中。但这些美白剂大都是作用于单一路径，美白效果往往不明显，另外，这些美白剂还具有一定的安全隐患，如熊果苷及曲酸可能会导致接触性皮炎，壬二酸会刺激皮肤而产生短暂性红斑。所以，开发具有良好安全性、稳定性，多通路美白机制的美白活性成分，已成为当前化妆品行业的主要研究方向之一，具有非常好的发展前景。

本文研制了一种高效的美白祛斑组合物，通过几种不同作用机制的美白活性成分进行复配，研制出效果较好的美白祛斑组合物，并通过体外细胞实验及人体实验评估其美白、祛斑功效。

1 实验部分

1.1 主要原料与仪器

1.1.1 主要原料

B16小鼠黑色素瘤细胞株、人角质细胞HaCaT细胞，购自中科院上海细胞库；DPPH、邻苯三酚、酪氨酸酶，L-酪氨酸，DMSO，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（FBS购自Gibco，Lot：2276321）；美白祛斑组合物，由广州环亚化妆品科技股份有限公司研制，该组合物的详细组分见表1。

表1 美白组合物各成分组成及含量

1.1.2 主要仪器

分析天平，A N D F X 3 0 0 0 i；恒温水浴锅HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司；自动酶标仪（美国BioTEK公司）；生化孵育箱、离心机（美国Thermo公司）；生物安全柜（美国Thermo Scientific公司）；CO2培养箱（德国MEMMERT公司）；皮肤生理无创检测设备均为来自德国CK公司，日本美能达公司分光光度仪（Spectrophotometer CM-2500d）等。

2 实验方法

2.1 人角质细胞 HaCaT细胞活力测试

将HaCaT细胞进行传代培养，制备浓度为（0.8～1.0）×105个/ml的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100 μl，培养18～24 h；然后弃去孔中原培养液，每孔依次加入100 μl维持培养基（阴性对照），以及含有0.5%、1%、5%、10%、15%、20%美白组合物的维持培养基，返回培养箱孵育（48±1）h；取出培养板，每孔加入20 μl MTT溶液，置于培养箱中孵育3～4 h，去除孔中液体，每孔加入100 μl DMSO，置于振荡器振荡10～15 min后，在酶标仪570 nm波长处测定吸光度。选择细胞活力大于80%作为受试物的安全浓度。细胞存活率计算公式见式1。

2.2 体外细胞美白实验测试

2.2.1 细胞内酪氨酸酶活性测试

细胞培养方法同2.1。样品作用浓度分别为2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；药物作用3 d后，舍弃上清液，用pH 7.0的PBS溶液冲洗两遍，每孔加90 μl含1% Triton X-100的PBS。冰水浴中超声破碎震荡5 min溶解细胞，经37 ℃预温后，每孔加入1% L-DOPA 10 μl，37 ℃下培育60 min，在酶标仪490 nm处测定各孔样品的吸光度。酪氨酸酶合成抑制率计算公式见式2。

2.2.2 细胞内黑色素含量测定

将B16黑色素细胞以10×104个/ml的密度接种于6板孔。每孔3 ml，培育24 h后，舍弃上清液，添加待测样品，浓度分别为5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%；样品作用3 d后，舍弃上清液，用PBS溶液洗涤，每孔加入胰酶0.5 ml消化细胞，加入2 ml培养液终止消化，分别计数每组细胞。将细胞悬液离心舍弃上清液，得到沉淀物，再加入含有10%的DMSO的1 mol/L NAOH溶液，震荡5 min。在酶标仪490 nm处测定各孔样品的吸光度。黑色素的合成抑制率计算公式见式3。

2.2.3 自由基清除实验

（1）超氧阴离子自由基清除作用的测定：取0.05 mol/L pH=8.2的Tris-HCl 缓冲液4.5 ml，于25 ℃水浴锅中预热20 min。再加入1 ml试样和0.4 ml 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25 ℃水浴中反应5 min，加入8 mol/L的HCl 1.0 ml终止反应。以Tris-HCl缓冲液作为参比，在299 nm处测吸光度值。空白对照用1 ml试样的溶剂来替代样品。待测液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式见式4。

式中A1为空白对照的吸光度值；A2为样品的吸光度值。

（2）对羟自由基的清除能力测定：在25 ml比色管中依次加入2 mmol/L FeSO43 ml，1 mmol/L H2O23 ml，摇匀，接着加入6 mmol/L水杨酸3 ml，摇匀，于37 ℃水浴加热15 min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15 min，取出测其吸光度。待测液对羧自由基（·OH）的清除率计算公式见式5。

式中A1为未加药品前反应体系的吸光度值；A2为样品清除·OH后体系的吸光度值；A3为空白对照清除·OH后体系的吸光度值。

2.3 人体美白测试实验

（1）测试方法及志愿者招募：根据《化妆品安全技术规范》2015版化妆品祛斑美白功效测试方法的具体要求进行检验。招募受试者共33人，其中男性6人，女性27人，年龄22～59岁，平均年龄（40.5±5.2）岁，符合受试者志愿入选标准和排除标准。

（2）紫外线黑化模型建立：首先测试入组的合格受试者背部的最小红斑量（minimal erythema dose，MED），然后在受试部位选定3个面积不小于6 cm2的试验区，分别为试验产品区、阴性对照区和阳性对照区，每个试验区之间的间隔不小于1.0 cm，并在每个试验区内选定面积不小于0.5 cm2的黑化测试区，用紫外线日光模拟仪按0.75倍MED剂量每天照射1次，连续照射4 d。

（3）肤色评测：照射结束后第5天，对各黑化测试区进行产品使用前的肤色视觉评估、皮肤色度仪、皮肤黑素检测仪的测试。以皮肤色度仪测试的L＊a＊b＊颜色空间数值计算ITA°值，计算公式见式6。

在涂抹试验物后每周对各黑化测试区皮肤颜色进行视觉评估和仪器检测，并记录。

（4）试验物涂抹：根据随机表在试验区按照（2.00±0.05）mg/cm2的用量涂抹试验物（阴性对照区不涂抹任何产品）。产品使用频率为2次/d（2次涂抹间隔时间不小于4 h），连续涂抹试验物4周。

试验产品：含2%美白祛斑组合物的美白祛斑精华露。

阴性对照：黑化区空白对照。

阳性对照：7%维生素C制品，按规范方法附录Ⅰ配方制备（4 ℃冷藏、铝管避光保存）。

3 实验结果与讨论

3.1 人角质细胞HaCaT细胞活力测试

测试美白祛斑组合物样品浓度分别为20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%对B16细胞增殖率的影响，结果见表2。

表2 不同质量浓度下样品对HaCaT细胞活力的影响

由表2实验结果可知，组合物作用浓度在20%及以内，人角质细胞HaCaT细胞活力均大于80%，表明在20%作用浓度内均为安全作用浓度。

3.2 细胞内酪氨酸酶活性抑制测试

通过体外酪氨酸酶实验测试美白祛斑组合物对酪氨酸酶的抑制效果，选择组合物测试浓度分别为5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，实验结果见表3。

表3 不同质量浓度下样品对酪氨酸酶的抑制率

从实验结果可以看出，本文制备的美白祛斑组合物在作用浓度为0.05%的浓度下，酪氨酸酶抑制率达到了60.47%，对酪氨酸酶的抑制效果随着美白组合物浓度的增加而提高，表现出良好的酪氨酸酶抑制作用。

3.3 细胞内黑色素合成的抑制率结果

通过体外测试美白祛斑组合物对B16黑色素细胞合成黑色素的抑制效果，选择测试浓度分别为5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，实验结果见表4。

表4 不同质量浓度下样品对黑色素生成的抑制率

从实验结果可以看出，本文制备的美白祛斑组合物在作用浓度为0.05%的浓度下，对黑色素生成的抑制率达到了55.49%，黑色素生成的抑制效果随着美白组合物浓度的增加而提高，表现出良好的抑制黑色素生成作用。

3.4 自由基清除实验测试结果

通过体外测试美白祛斑组合物对超氧阴离子自由基及羟自由基的清除效果，选择测试浓度分别为5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.1%，实验结果见表5。

表5 不同质量浓度下样品对自由基的清除效果

从实验结果可以看出，本文制备的一种美白祛斑组合物对超氧阴离子自由基和羟自由基具有一定的清除作用。在作用浓度达到2%时，清除两种自由基效果分别达到了75.35%和72.05%，其清除自由基的效果随着美白组合作用浓度的增加而增强。

3.5 人体美白测试结果分析

表7 受试物使用前后皮肤ITA°差值（均值±标准差）

在做完美白组合物的体外酪氨酸酶抑制实验、黑色素抑制实验以及自由基清除实验后，选择使用浓度为2%的美白祛斑组合物添加到精华露中，制备得到含有2%美白祛斑组合物的美白祛斑精华露，并通过人体实验验证样品的美白效果。结果见表6～表8。

表6 受试物使用前后视觉肤色评估差值[中位数（最小值，最大值）]

表8 受试物使用前后皮肤MI差值（均值±标准差）

根据表6～表8的实验结果可以得出，实验产品（含2%美白祛斑组合物的美白祛斑精华露）紫外线诱导人体皮肤黑化模型祛斑美白功效测试的结果为：实验产品涂抹3周、4周后，肤色视觉评分在涂抹前后差值与阴性对照相比有显著改善（P＜0.05）；涂抹3周、4周后，ITA°在涂抹前后差值与阴性对照相比有显著改善（P＜0.05）；涂抹1周、2周后，MI在涂抹前后差值与阴性对照相比有显著改善（P＜0.05）；整体判断实验产品与阴性对照相比皮肤黑化显著改善（P＜0.05），表明2%美白祛斑组合物的美白祛斑精华露具有祛斑美白功效。

4 结论

本文研制了一种具有高效美白效果的美白祛斑组合物并通过体外和人体实验评价了组合物的美白祛斑效果。

（1）采用人角质细胞HaCaT细胞活力测试验证了组合物的安全性能，在作用浓度在20%及以内，人角质细胞HaCaT细胞活力均大于80%，表明在20%作用浓度内均为安全使用浓度。

（2）采用体外酪氨酸酶及黑色素抑制实验测试，结果得出，美白祛斑组合物对酪氨酸酶及黑色素合成抑制率最高可达到99.15%和91.37%。

（3）通过体外自由基清除实验，验证美白祛斑组合物具有一定的自由基清除功效，对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除效果，最高可达到88.23%及86.65%

（4）采用2%美白祛斑组合物，制备得到美白祛斑精华露，并按照《化妆品安全技术规范》2015版化妆品祛斑美白功效测试方法，通过人体实验测试结果可得出，2%美白祛斑组合物的美白精华露具有良好的美白祛斑效果，受试者在使用产品4周后，在肤色视觉评分、ITA°、黑色素MI值等多项指标上具有显著性的改善（P＜0.05），样品具有良好的美白祛斑功效。