包 华 李 康 钟睦琪 郝智慧*

(1.青岛农业大学 化学与药学院，山东 青岛 266109； 2.中国农业大学 动物医学院/中兽医创新中心，北京 100193)

番茄是世界上种植面积第二大的蔬菜，也是我国重要的经济作物。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(

Botrytis

cinerea

)侵染引起的一种世界性番茄病害，其传播速度快且危害重，是番茄上发生最严重且最频繁的病害。该病主要危害果实，造成果实腐烂，也可危害叶、茎和花，极大影响了番茄产量，严重时可减产20%～30%，给农户带来巨大的经济损失。

近年来，番茄灰霉病以化学药剂防治为主，不仅污染环境，而且易使病菌产生抗药性，导致防效降低。植物源农药是国内外新农药研发热点之一。植物源农药取材于植物中的天然活性成分，在自然环境中可被有效降解，同时可以有效杀死或有效抑制病原菌的生长，其种类繁多、资源丰富，并且无残留，低毒或无毒，不易使病原菌产生抗性。植物源农药结构类型涉及萜类、生物碱类、黄酮类、醌类、酯类、酚类、醛类、醇类、甾类、有机酸及精油类等化合物。

目前，国内外有关植物体内生物碱化合物的分离及抑菌作用研究较多，相关报道也证明了生物碱对植物病原菌具有显著的抑制作用。如小檗碱能抑制水稻细菌性条斑病菌的正常生长，并使其致病力降低；0.5%苦参碱水剂防治苹果树腐烂病效果优异，明显优于市场上常用的40%福美砷；胡椒碱的类似物荜茇宁酰胺对枯草芽孢杆菌具有很强的抑制活性。

胡椒碱是胡椒科植物特有的一种生物碱，具有良好的抗炎和抗菌作用，如黑胡椒石油醚提取物可破坏大肠杆菌以及金葡萄球菌细胞壁和细胞膜结构，从而达到抑菌效果。但胡椒碱对植物病原菌抑制效果的研究鲜有报道，本研究通过测定胡椒碱对番茄灰霉病菌抑菌活性，以及从显微结构、细胞膜通透性和酶活性等方面探究胡椒碱对番茄灰霉病菌的作用机理，以期为胡椒碱的田间利用及植物源农药的研制开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄灰霉病菌由青岛农业大学绿色农药研究所提供，于4 ℃条件下保存。将保存的菌种转接到培养平板上进行活化，置于26 ℃恒温培养箱中培养至菌丝长满整个平板，用打孔器沿菌落外缘打取直径为5 mm的菌饼备用。

胡椒碱(Piperine，纯度≥98%)购于上海麦克林生物科技有限公司，PDA培养基、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、琥珀酸脱氢酶(SDH)试剂盒、NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)试剂盒、考马斯亮蓝(G-250)和牛血清白蛋白(BSA)购于北京索莱宝有限公司，二甲基亚砜(DMSO)和葡萄糖购于国药化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1

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2

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1

胡椒碱溶液的配制

准确称取胡椒碱20 mg，用DMSO溶解，配置成20 000 mg/L的胡椒碱储备液。

1

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2

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2

番茄灰霉病菌抑菌活性和产孢量的测定采用生长速率法测定胡椒碱对番茄灰霉菌的抑菌活性。将配置好的储备液添加到PDA培养基(约50 ℃)中，配置成质量浓度分别为200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L的含药培养基，摇匀后倒平板；以添加相同浓度的百菌清为阳性对照，以添加相同剂量(200.0 μL)的DMSO的培养基作为阴性对照(CK)，在培养基中央接种

d

=5 mm经纯培养的番茄灰霉菌菌丝圆片，26 ℃恒温培养。4 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制生长率，每处理3次重复。采用浓度对数-抑制率概率值法求取毒力回归方程及半数效应浓度(EC)。将番茄灰霉病菌接种在PDA培养基上，26 ℃恒温培养7 d，待对照产生大量分生孢子后，用无菌水洗脱孢子，配置成孢子悬浮液，计算产孢抑制率。计算公式如下：

抑制率=

(1)

产孢抑制率

(2)

1

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2

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3

番茄灰霉病菌孢子萌发的测定

番茄灰霉病菌培养7～8 d后使其产孢，加无菌水配制成孢子悬浮液数量为1×10CFU/mL，在凹玻片上加入与1.2.2相同质量浓度的胡椒碱，26 ℃黑暗条件下培养12 h后，计算孢子萌发率。

孢子萌发率

(3)

1

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2

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4

番茄灰霉病菌菌丝形态测定

配置质量浓度为25.0、50.0和100.0 mg/L的PDA培养基。在平皿中央接种番茄灰霉病菌，在菌落边缘斜插盖玻片，待菌丝长到盖玻片上，取出，通过扫描电镜观察菌丝形态并进行比较。

1

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2

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5

番茄灰霉病菌菌体可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法测定菌丝可溶性蛋白含量。

1

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2

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6

番茄灰霉病细胞膜通透性的测定

采用电导率法，将PDB培养液中的菌丝培养3 d，于对数生长期取出，用超纯无菌水冲洗4次，用滤纸吸干水分。称取1.5 g菌丝均分为6份，分别加到质量浓度为200.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L含胡椒碱溶液的去离子水和对照组中，对照组加上等量的去离子水，在环境条件为25 ℃时分别测定0、1、2、3、4、5和6 h电导率。根据电导率变化，观察胡椒碱对细胞膜通透性的影响。

1

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2

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7

番茄灰霉病菌菌体相关酶(SOD、CAT、POD、SDH和NAD

-

MDH)活性测定

按照1.2.6取菌丝方法，将菌丝冰浴研磨成匀浆后离心，取得上清液为粗酶液，将粗酶液(菌丝)按照参考文献[19]方法进行操作，加入所需试剂。SOD酶活性测定将560 nm吸光度下以黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时定义为 1个活力单位，CAT酶活性测定将240 nm吸光度下每毫克蛋白每分钟减少0.01吸光度定义为1个活力单位，POD酶活性测定将470 nm吸光度下每毫克蛋白每分钟增加0.01吸光度定义为1个活力单位，SDH酶活性测定将600 nm吸光度下每毫克蛋白每分钟使反应体系吸光度降低0.01为1个活力单位，NAD-MDH酶活性测定将340 nm吸光度下每毫克蛋白每分钟使反应体系吸光度降低0.01为1个活力单位。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2007和Graphpad进行数据统计和绘图，利用SPSS 19.0进行数据的方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌生长的抑制作用

不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌的抑菌活性测定结果见表1。毒力回归方程为

y

=3.849 6+0.904 2

x

，相关系数

R

≥0.95。试验结果表明，不同质量浓度的胡椒碱对番茄灰霉病抑制效果显著差异，随着质量浓度的增加抑菌率也在增加，呈剂量依赖性。当胡椒碱质量浓度为200.0 mg/L时，其抑菌率为80.61%。胡椒碱对番茄灰霉病菌菌丝生长EC为18.72 mg/L，其置信限为8.30～42.24 mg/L。阳性对照药物百菌清对番茄灰霉病菌EC为20.65 mg/L，由此可见胡椒碱对番茄灰霉病菌的抑制效果优于百菌清对番茄灰霉病菌的抑制效果。

表1 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of piperine against with different mass concentrations

质量浓度/(mg/L)Mass concentration质量浓度对数Mass concentrationlogarithm菌落直径/cm Colony diameter123平均值抑制率/%Inhibition rateEC50/(mg/L)05.755.705.765.7412.51.093.553.453.373.4643.5325.01.402.903.03.062.9952.4950.01.702.132.262.42.2666.3218.72100.02.001.571.631.791.6677.87150.02.181.601.611.651.6278.63200.02.301.501.531.521.5280.61

2.2 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子产量的影响

胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子产量抑制结果见图1。不同质量浓度的(200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L)胡椒碱处理番茄灰霉病菌后，孢子数量分别为3.04×10、5.62×10、7.20×10、13.58×10、18.00×10和21.38×10cfu/mL，对应的孢子产孢抑制率分别为88.30%、78.36%、72.27%、47.75%、30.77%和17.79%，孢子产孢量EC为45.11 mg/L。与CK对比，产孢量显著下降。上述结果表明，胡椒碱对番茄灰霉病菌产孢量具有明显抑制效果，且质量浓度越大，抑制效果越好。

不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。 Different letters represent significant differences (P<0.05), while the same letters represent no significant differences (P>0.05). The same below.图1 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子产生的影响Fig.1 The effect of different mass concentrations of piperine on the spore production of B. cinerea

2.3 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子萌发的影响

载玻片萌发法测定番茄灰霉病菌孢子萌发结果表明(图2)，随着胡椒碱质量浓度的增加，对孢子萌发的抑制作用增强。胡椒碱质量浓度在200.0 mg/L下，孢子萌发率为16.92%，孢子萌发抑制率高达88.81%。高质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子萌发具有较强的抑制效果，胡椒碱对孢子萌发EC为38.86 mg/L。

2.4 胡椒碱对番茄灰霉病菌超微结构的影响

通过扫描电镜观察，不同质量浓度胡椒碱处理的番茄灰霉病菌菌丝形态与对照相比存在明显差异。对照组菌丝粗细均匀、形态规则(图3(a))；处理组菌丝变细、节间拉长、菌丝干瘪和坍塌(图3(b)～(d))。

2.5 胡椒碱对番茄灰霉病菌菌丝体可溶性蛋白含量的影响

采用胡椒碱处理后的番茄灰霉病菌菌丝体(表2)可溶性蛋白含量随着胡椒碱质量浓度的升高呈降低的趋势，说明胡椒碱影响了可溶性蛋白的合成或是破坏了细胞膜结构从而造成可溶性蛋白流失。

图2 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌孢子萌发的影响Fig.2 The effect of different mass concentrations of piperine on spore germination of B. cinerea

2.6 胡椒碱对番茄灰霉菌体细胞膜渗透性的影响

采用电导率法测定了胡椒碱对番茄灰霉菌体细胞膜渗透性的影响，结果如图4所示。未经胡椒碱处理的菌液(CK组和DMSO组)电导率在作用1～6 h内基本没有变化，经胡椒碱处理后的菌液电导率均有不同程度的变化。当胡椒碱作用时间超过2 h时，随着胡椒碱质量浓度的增大，电导率也随之增大；作用时间相同时，胡椒碱质量浓度越大，相应菌液的电导率也越大。说明经胡椒碱处理后的番茄灰霉病菌菌丝细胞膜受到损伤，细胞内的小分子如Na、K和Ca等离子外漏，导致电导率发生变化。

2.7 胡椒碱对番茄灰霉病菌菌体酶活系统的影响

2

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7

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1

胡椒碱对番茄灰霉病菌抗氧化酶(SOD、CAT和POD)相关活性的影响

胡椒碱对番茄灰霉病菌菌体SOD、CAT和POD酶活性的影响如图5所示。从图中可以看出，经200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒碱处理的番茄灰霉病菌菌体SOD、CAT和POD酶活性均显著低于对照组，且菌体SOD、CAT和POD酶活性随着胡椒碱质量浓度增加呈现下降趋势。说明胡椒碱抑制了番茄灰霉病菌菌体内抗氧化酶系统活性，导致菌体内活性氧离子不能被及时清除，从而达到抑菌效果。

2

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7

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2

胡椒碱对番茄灰霉菌体SDH和NAD

-

MDH酶相关活性的影响

胡椒碱对番茄灰霉病菌菌体SDH和NAD-MDH酶活性的测定结果如图6所示。经200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒碱处理的番茄灰霉病菌菌体SDH和NAD-MDH酶活性均显著低于对照组，

图3 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌菌丝形态的影响Fig.3 The effect of different mass concentrations of piperine on the hyphae morphology of B. cinerea

表2 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌菌丝体 可溶性蛋白含量的影响
Table 2 The effect of different mass concentrations of piperine on the soluble protein of

质量浓度/(mg/L)Massconcentration可溶性蛋白质量分数/(mg/g)Soluble protein massconcentration抑制率/%Inhibitionrate03.617±0.100 a-12.53.291±0.070 a9.0225.02.875±0.090 b20.5250.02.756±0.160 b23.79100.02.132±0.010 c41.05200.01.191±0.080 d67.06

注：同列数据不同字母表示差异显著(<0.05)。

Note: Within the same column, different letters represent significant differences (<0.05).

图4 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌 细胞膜通透性的影响Fig.4 The effect of different mass concentrations of piperine on the cell membrane permeability of B. cinerea

且菌体SDH和NAD-MDH酶活性随着胡椒碱质量浓度增加呈现下降趋势。SDH和NAD-MDH酶是三磷酸循环中2种重要的氧化还原酶，胡椒碱通过降低番茄灰霉病菌菌体SDH和NAD-MDH酶活力，从而抑制菌体内的能量代谢，最终抑制菌体生长。

图5 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌抗氧化酶活性的影响Fig.5 The effect of different mass concentrations of piperine on the activity of antioxidant enzymes of B. cinerea

图6 不同质量浓度胡椒碱对番茄灰霉病菌SDH和NAD-MDH酶活性的影响Fig.6 The effect of different mass concentrations of piperine on the enzyme activities of SDH and NAD-MDH of B.cinerea

3 讨论与结论

目前，胡椒碱及其衍生物对植物病原真菌的研究主要集中在抑菌活性方面，但胡椒碱对植物病原真菌抑菌机理尚不明确。基于此，本研究通过胡椒碱对番茄灰霉病菌抑菌机理展开研究，进而确定抑制靶点。本研究结果表明，胡椒碱对番茄灰霉病菌菌丝孢子的产生和萌发均具有强烈的抑制作用，胡椒碱可造成菌丝生长畸形，并使其产孢能力、芽管长度和孢子萌发率下降。这与张新虎等研究的苍耳提取物对孢子和菌丝的抑制作用结果一致，表明胡椒碱中可能含有能抑制孢子和菌丝呼吸作用的活性物质，并通过抑制孢子和菌丝的呼吸而实现抑菌作用。可溶性蛋白作为重要的渗透调节物质和营养物质，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，其含量变化是衡量生物活性的一个重要的生理指标。本研究发现，番茄灰霉病菌经胡椒碱处理后菌液电导率上升，说明其细胞膜渗透性发生改变。进一步测定番茄灰霉病菌可溶性蛋白含量发现，胡椒碱处理后番茄灰霉病菌的可溶性蛋白含量出现明显下降，表明胡椒碱主要通过抑制可溶性蛋白的合成，致使细胞膜受损而导致菌丝死亡。

抗氧化酶作为细胞内重要的保护酶系广泛分布于生物体内，通过分工协作共同清除细胞内活性氧类。SOD酶可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢，尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的CAT酶和POD酶会立即将其分解为完全无害的水。只有3种酶共同协作才可组成一个完整的防氧化链，但目前研究中仅少数药物可同时对这3种抗氧化酶产生抑制效果。周杰辰等研究表明黄檀炭疽病菌经垂序商陆与胜红蓟乙酸乙酯提取物处理后，SOD酶活力降低，CAT酶活力升高。本研究通过胡椒碱处理番茄灰霉病菌菌体后，菌体SOD、POD和CAT酶活性均显著下降，与周杰辰等研究结果不同。表明胡椒碱可通过抑制番茄灰霉病菌菌丝细胞中的防御酶活性从而抑制菌丝生长。此外，通过测定胡椒碱对番茄灰霉病菌菌体SDH和NAD-MDH酶活性，结果显示SDH和NAD-MDH酶活性均有不同程度的降低。SDH和NAD-MDH酶是三羧酸循环中的关键酶，三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为细胞通过呼吸代谢获取能量，所以三羧酸循环受阻将导致细胞死亡。番茄灰霉病菌菌体中的SDH和NAD-MDH酶活性被胡椒碱抑制，导致菌丝体活力下降，从而对菌丝生长起到了抑制作用。

在研究胡椒碱对番茄灰霉病菌抑菌机理基础上，为提高对番茄灰霉病菌抑制效果，还有很多工作要做。如在盆栽或者大田条件下应用胡椒碱对活体番茄灰霉病菌抑制效果进行测定，以便胡椒碱更好应用于实践生产中。此外，还应通过分子层面上探索胡椒碱对番茄灰霉病菌抑制作用，更深一步的探讨其作用靶点。

从植物中筛选出活性更高的化合物，寻找更为理想的杀菌剂，是当前十分活跃的研究领域。本研究表明，胡椒碱对番茄灰霉病菌有着良好的抑制效果，可针对多靶点进行抑制，研究结果为番茄灰霉病菌的防治提供了新方向，为新型无公害防治药剂的研制提供了基础理论依据和参考借鉴。