刘乔斐，周自云

（1.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000；2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100）

柴胡为伞形科（Umbelliferae）柴胡属（Bupleurum）多年生草本植物，主要以干燥的根入药，是中国和亚洲诸多国家常用的大宗中药材。现有研究表明一年生柴胡根中皂苷含量比二年生的高，某些产区也可当年入药［1］。柴胡味苦、辛，性微寒，具退热解表、升举阳气、疏肝解郁之功效，多用于治疗感冒发热、头痛目眩、月经不调、子宫下垂等症状［2］。柴胡皂苷是柴胡最主要的药效成分，其中以柴胡皂苷a、d的含量较高、活性较强［3］，被广泛用于临床。

随着全球气候干暖化的持续加剧，水分已成为世界干旱半干旱地区植物生长发育的首要限制因子之一。中国多数地区降水年际分布不均，药用植物在自然条件下生长，难免会面临水分不足（干旱胁迫）和水分过多（涝渍）等不同生长环境［4］。水分过少或过多均可引起植物细胞生理脱水或缺氧，导致膜脂过氧化，打破渗透平衡，影响次生代谢产物的合成，进而影响药用植物的生长发育和药材质量［5］。黄璐琦等［6］研究发现水分胁迫能促进次生代谢产物的合成，更有利于道地药材的形成。次生代谢产物的积累是道地药材研究的热点之一，也是中药材生产的目的所在［7］。近些年，中药材在生长过程中频繁遭受干旱的危害，而研究药用植物对干旱胁迫的应答机制会为解决中药材问题提供一个崭新的途径。

柴胡耐寒且耐旱，忌高温和涝洼积水，主产于甘肃、山西、河北、陕西等干旱半干旱地区［8］。柴胡栽培过程中常遇到干旱或者涝渍的情况，生长发育与水分密切相关［9］；水分过多会导致根系多分布于浅层，容易烂根，诱发疾病；水分过少抑制柴胡生长，严重影响其产量和品质［10］。因此，探索柴胡生长过程的需水规律对柴胡提质增效人工栽培技术具有重要的促进作用。本研究针对中国柴胡主产区土壤水分状况，采用盆栽模拟控水条件，通过对柴胡根冠比、渗透调节物质和柴胡皂苷的测定，从生理角度开展柴胡水分逆境研究，旨在为柴胡种植中科学的水分管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用二年生北柴胡（Bupleurum chinenseDC.），在陕西省宝鸡市陈仓区拓石镇孟家塬村陕西博仁药业柴胡基地开展盆栽试验。选用上口径25 cm、高20 cm的塑料花盆，每盆装土2.5 kg，供试土壤为沙壤土，其田间持水量为20.42%。于2019年4月1日将柴胡幼苗移栽入塑料盆中，每盆3穴，每穴1株。移栽后正常浇水，缓苗7 d后进行水分胁迫处理。为避免柴胡根系伸出土壤、保持盆内水分恒定，在每个塑料盆下面垫一张塑料纸。

试验采用单因素完全随机区组试验设计，设置4个水分梯度：田间持水量的30%、50%、70%和90%，分别对应土壤含水量的6.13%、10.21%、14.29%和18.56%，其中以田间持水量的70%作为对照（CK）。各水分梯度分别对应柴胡幼苗4种生长条件：重度干旱胁迫、轻度干旱胁迫、适宜水分、涝渍。4月7日开始采用称重法进行水分控制。控水期间每天下午18：00定时称盆重量，以盆质量的减少量为柴胡的当日耗水量，并加水补充至设定土壤含水量，并设置对照盆（裸土），以扣除土面蒸发。每个处理设置3个重复，称重控水一个月后采集样品测定各指标。

1.2 主要仪器与试剂

Waters高效液相系统配有：Waters1525二元泵，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters sun-fire C18色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），Empower 2色谱分析软件；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；3K15型台式高速冷冻离心机（SIGMA）；紫外可见分光光度计（PerkinElmer Lambda 35）。柴胡皂苷对照品均购于中国食品药品检定研究院（柴胡皂苷a批号110777-201309，柴胡皂苷d批号110778-201409），乙腈为色谱纯（美国Tedia公司），氨水、甲醇等均为分析纯。

1.3 测试项目与方法

1.3.1 柴胡根冠比和相对含水量的测定 从每组处理中随机选取3株长势一致的柴胡植株，分别称量地上鲜重、地下鲜重；迅速将样品放入铝盒中浸水直至样品饱和重量近似，称量地上饱和鲜重、地下饱和鲜重；之后将样品放入105℃烘箱杀青30 min后80℃烘干至恒重，称量地上干重、地下干重；根据上述指标计算柴胡的根冠比（Root/top，R/T）和相对含水量（Relative water content，RWC）［11］。

水分胁迫结束后，采用NMI20-015V-I核磁共振成像分析仪（上海纽迈电子科技有限公司）测定柴胡叶片水分子动力学特征。测定时磁体箱温度设定为32℃，磁感应强度为0.5 T，1H核磁共振主频率为23.04 MHz；核磁共振T2弛豫谱检测采用（Carr Purcell Meiboom Gill）CPMG脉冲序列，参数设定和测定方法参考牟红梅等［12］的方法，根据信号值计算样品中自由水、结合水和吸附水的百分比含量。

1.3.2 渗透调节物质的测定 参考高俊凤［11］的方法，可溶性糖含量（Soluble sugar）的测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白质含量（Soluble protein）的测定采用考马斯亮蓝G-250比色法；脯氨酸含量（Proline）的测定采用酸性茚三酮比色法；丙二醛含量（Malonaldehyde）的测定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.3.3 HPLC测定柴胡根中皂苷a、d的含量 参考张宇等［9］的方法，取干燥至恒重的柴胡根研磨成粉末，准确称取0.2 g于10 mL离心管中，加含5%浓氨水的甲醇溶液8 mL，密闭，超声提取30 min，取出，滤过，并用10 mL甲醇分2次洗涤离心管和残渣，7 000 r/min离心10 min，取上清，洗液和滤液合并，回收溶剂至干。残渣用适量甲醇溶解，并定量转移至5 mL容量瓶中，定容至刻度。上样前用0.45 μm滤膜滤过，作为样品溶液。HPLC条件参照2010年版《中华人民共和国药典》［13］。

1.4 数据处理

利用Empower 2色谱分析软件导出柴胡皂苷a、d的峰面积，分别带入回归方程Y=5 853 177.018 2X＋144 215.517 1，R2=0.999；Y=6 601 254.089 9X＋30 563.820 8，R2=0.999，计 算 柴 胡 皂 苷a、d的 含量［14］。采用核磁仪器自带的反演软件T_InvfitGeneral对CPMG回波的峰值点进行Laplace反演分析，获得核磁共振T2弛豫谱。柴胡幼苗核磁共振T2弛豫谱中不同相态水分峰面积即T2弛豫谱幅值的提取采用Matlab编程处理。数据应用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并采用LSD和Duncan多重比较法进行显著差异性检验；采用SigmaPlot 12.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫对柴胡幼苗根冠比和水分的影响

由图1可知，水分胁迫对柴胡植株根冠比（R/T）的影响显著。30%田间持水量、90%田间持水量下柴胡R/T分别较CK显著降低了21.60%和37.30%，50%田间持水量下柴胡R/T反而较CK显著提高了23.76%。各处理下柴胡R/T呈50%田间持水量＞CK＞30%田间持水量、90%田间持水量的趋势，说明土壤水分过少或过多均不利于柴胡根冠比的提高。

图1 水分胁迫对柴胡根冠比的影响

由图2可知，水分胁迫对柴胡叶片相对含水量（RWC）的影响显著。叶片相对含水量反映植物在遭受干旱胁迫后的水分亏缺状况，与CK相比，水分胁迫下柴胡叶片RWC有所降低，30%田间持水量下柴胡叶片RWC较CK显著降低了3.26%，50%田间持水量和90%田间持水量下柴胡叶片RWC稍有降低，但与CK差异不显著。

图2 水分胁迫对柴胡叶片相对含水量的影响

由图3可知，水分胁迫对柴胡叶片自由水与结合水的比值（Free water/bound water，FW/BW）的影响显著。随着田间持水量的降低，FW/BW逐渐降低。30%田间持水量、50%田间持水量下柴胡叶片FW/BW分别较CK显著降低了47.36%和29.47%，90%田间持水量下柴胡叶片FW/BW较CK显著提高了57.32%。说明随着田间持水量的降低，柴胡叶片自由水含量逐渐降低，结合水含量相对增加，柴胡细胞代谢逐渐减慢。

图3 水分胁迫对柴胡叶片FW/BW的影响

2.2 水分胁迫对柴胡体内渗透调节物质的影响

由图4可知，水分胁迫对柴胡可溶性糖含量的影响显著。水分胁迫显著提高柴胡可溶性糖含量。30%田间持水量、50%田间持水量和90%田间持水量下柴胡可溶性糖含量分别较CK显著提高了149.78%、40.96%和30.95%。50%田间持水量下柴胡可溶性糖含量与90%田间持水量下柴胡可溶性糖含量的差异不显著。各处理下柴胡可溶性糖含量呈30%田间持水量＞50%田间持水量、90%田间持水量＞CK的趋势，表明水分胁迫有利于提高柴胡体内可溶性糖含量。

图4 水分胁迫对柴胡可溶性糖含量的影响

由图5可知，水分胁迫对柴胡可溶性蛋白质含量的影响显著。随着田间持水量的降低，柴胡可溶性蛋白质含量逐渐减少。30%田间持水量、50%田间持水量下柴胡可溶性蛋白质含量分别较CK显著降低了45.07%和25.68%，90%田间持水量下柴胡可溶性蛋白质含量较CK显著提高了39.79%。各处理下柴胡可溶性蛋白质含量呈30%田间持水量＜50%田间持水量＜CK＜90%田间持水量的趋势。

图5 水分胁迫对柴胡可溶性蛋白质含量的影响

由图6可知，水分胁迫对柴胡脯氨酸含量的影响显著。30%田间持水量、50%田间持水量下柴胡脯氨酸含量分别较CK显著增加了176.10%和49.10%，90%田间持水量下柴胡脯氨酸含量较CK有所提高，但差异不显著。各处理下柴胡脯氨酸含量呈30%田间持水量＞50%田间持水量＞90%田间持水量＞CK的趋势，表明水分胁迫有利于提高柴胡体内脯氨酸含量。

图6 水分胁迫对柴胡脯氨酸含量的影响

2.3 水分胁迫对柴胡膜脂过氧化作用的影响

丙二醛通常作为膜脂过氧化指标，可反映植物受伤害程度。由图7可知，水分胁迫对柴胡丙二醛含量的影响显著。与CK相比，30%田间持水量下柴胡丙二醛含量显著提高了89.56%，50%田间持水量、90%田间持水量下柴胡丙二醛含量与CK无显著差异。各处理下柴胡丙二醛含量呈30%田间持水量＞50%田间持水量、90%田间持水量、CK的趋势，表明重度干旱胁迫加剧了柴胡细胞膜脂过氧化作用。

图7水分胁迫对柴胡丙二醛含量的影响

2.4 水分胁迫对柴胡皂苷的影响

图8 为水分胁迫对柴胡皂苷a含量的影响。由图8可知，50%田间持水量下柴胡皂苷a含量较CK显著增加了28.67%，30%田间持水量、90%田间持水量下柴胡皂苷a含量与CK差异不显著。各处理下柴胡皂苷a含量呈50%田间持水量＞30%田间持水量、CK、90%田间持水量的趋势，说明轻度干旱胁迫有利于柴胡皂苷a的积累。

图8 水分胁迫对柴胡皂苷a含量的影响

图9为干旱胁迫对柴胡皂苷d含量的影响。由图9可知，随着田间持水量的降低，柴胡皂苷d含量逐渐增加。与CK相比，30%田间持水量下柴胡皂苷d含量显著增加了24.78%，90%田间持水量下柴胡皂苷d含量显著降低了14.98%，50%田间持水量下柴胡皂苷d含量与CK差异不显著。各处理下柴胡皂苷d含量呈30%田间持水量＞50%田间持水量、CK＞90%田间持水量的趋势，表明重度干旱胁迫有利于柴胡皂苷d的积累。

图9水分胁迫对柴胡皂苷d含量的影响

图10 为水分胁迫对柴胡皂苷（a＋d，Saikosaponins）含量的影响。由图10可知，干旱胁迫显著提高柴胡皂苷的含量。30%田间持水量、50%田间持水量下柴胡皂苷含量分别较CK显著提高了17.36%和19.75%，90%田间持水量下柴胡皂苷含量与CK无显著差异。各处理下柴胡皂苷含量呈30%田间持水量、50%田间持水量＞CK、90%田间持水量的趋势。

图10 水分胁迫对柴胡皂苷含量的影响

3 讨论

植物在应对干旱胁迫时会启动多种生理反应来增强自身的抗逆性能［15］。研究表明，水分胁迫时，植物细胞会积累可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，防止水分流失［16］。本试验结果发现，干旱胁迫下柴胡幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量均显著提高，且随着干旱胁迫程度的增强，可溶性糖和脯氨酸含量不断增加，而可溶性蛋白质含量却随着土壤含水量的减少而减少，这与前人的研究结果一致［17］。干旱时植物体内的蛋白质分解加速，合成减少，与之相适应的是植物体内游离氨基酸，特别是脯氨酸含量大幅度增加。脯氨酸作为重要的渗透调节物质，在含水量很低的细胞内通过与蛋白质相互作用来增强蛋白质的水合作用，也可与胞内一些化合物形成类似亲水胶体的聚合物，防止水分散失［16］。可溶性糖增多有利于细胞从外界水势高的地方吸水，保护细胞不受干旱的损伤，有利于提高柴胡幼苗的抗旱性能。植物在遭受干旱和涝渍胁迫时，植物体内氧代谢失调，保护酶防御系统遭到破坏，大量的活性氧在植物体内积累，引起生物膜脂的脱酯化和膜脂的过氧化，导致膜脂过氧化产物如丙二醛累积［18］。本研究表明，重度干旱胁迫下柴胡体内丙二醛含量显著增加，而轻度干旱胁迫和涝渍胁迫下柴胡丙二醛含量与对照均无显著差异。丙二醛含量的升高表明重度干旱胁迫造成柴胡体内酶保护反应和自由基生成的动态平衡失衡，进而导致膜脂过氧化程度升高。

土壤水分对植物根系生长发育具有直接调控作用。根类中药材作为一类特殊的植物，其生长和药效成分的合成积累与环境水分密切相关［19］。适宜水分条件下，药用植物根系生长良好，构型合理，产量高，但不利于药效成分的合成［20］。研究表明，适度干旱胁迫可以调节植物地上、地下生物量的分配，促进根系生长，增加根冠比［21］，增强植物体内次生代谢，促进药效成分的合成与积累［22］，从而提高中药材的产量与品质。本试验结果发现，轻度干旱胁迫下柴胡根冠比显著增大，而重度干旱胁迫和涝渍下柴胡根冠比均显著减小，说明柴胡可以通过调节自身的生长来应对水分胁迫，土壤水分严重亏缺和过多都不利于柴胡根系建成，而轻度干旱胁迫可以促进柴胡根系生长，进而促进产量的提高。随着水分亏缺，植株含水量逐渐减少，特别是自由水与结合水的相对比值减小，植物组织自由水相对含量降低，细胞代谢减慢，结合水相对含量增加，抗逆性能增强［16］。干旱胁迫显著降低柴胡幼苗的RWC和FW/BW，其中重度干旱胁迫下柴胡幼苗的RWC和FW/BW最低，这与前人的研究结果一致［23］。而90%田间持水量下柴胡幼苗的FW/BW反而最大，这一结果正解释了植物体内自由水含量受环境影响较大，可参与代谢活动，而结合水含量较为稳定。

许多研究表明，干旱胁迫可以增加植物次生代谢产物的生成和积累。曾智等［24］研究发现，适度干旱和适量钾肥有利于厚朴中主要药效成分厚朴酚与和厚朴酚的积累。孔德鑫等［25］研究发现适当的干旱胁迫有利于2种鸡骨草中皂苷含量的积累。邓婉月等［26］研究发现，用浓度为50～100 g/L的PEG-6000溶液模拟轻度和中度干旱胁迫，有利于丹参中酚酸和丹参酮类活性成分的积累，为丹参生产中科学控水、提质增效提供理论参考。本研究发现，干旱胁迫可显著促进柴胡皂苷的积累。轻度干旱胁迫对柴胡皂苷a的积累影响显著，而重度干旱胁迫对柴胡皂苷d的积累影响显著，而土壤水分过多时2种皂苷含量都显著降低。这主要是由于水分适宜或过多时，柴胡体内主要通过初生代谢合成糖、蛋白质、核酸等维持生命活动的必需物质，只产生少量的次生代谢物满足日常需要；当环境水分亏缺至干旱胁迫时，柴胡幼苗生长受到抑制，同化产物减少，次生代谢增强，次生代谢产物积累用于抵御逆境胁迫［9］；但若干旱胁迫持续加剧，柴胡自身生长受阻，次生代谢产物合成最终也会减少。类似的结果前人研究也有报道，梁建萍等［27］研究发现，轻度水分胁迫能有效启动黄芪体内次生代谢，通过降低地上部分的生长，将营养物质优先运往根部，促进根产量及药材质量的提高；胡娅婷等［19］研究发现，轻度干旱胁迫能够有效促进黄芪幼苗生长并提高黄芪药材品质，但重度干旱胁迫超过了黄芪所能承受的抗逆能力，次生代谢物含量降低。

4 小结

轻度干旱胁迫显著增加柴胡根冠比、柴胡皂苷a和总皂苷的含量，重度干旱胁迫显著增加柴胡体内可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、柴胡皂苷d和总皂苷的含量，可溶性蛋白质和FW/BW随着干旱胁迫程度的增加逐渐减小。综上，柴胡具有一定的耐旱性；干旱胁迫有利于柴胡生物量向地下部转移，可以促进柴胡有效成分的积累，而土壤水分过多不利于柴胡根系生长和柴胡皂苷的积累。因此，在人工栽培柴胡时，要避免低洼易积水地块，采用科学合理的控水方式，在保障植物正常生长时也能促进柴胡皂苷等次生代谢产物的积累，提高柴胡的产量和品质。