王丹丹，王 鹏，韩智阳,刘丹梅

(辽东学院农学院，辽宁 丹东 118000)

赤芍(RadixpaeoniaeRubra)，又名毛果赤芍、木芍药或红芍药，隶属于毛莨科(Ranunculaceae)芍药(PaeonialactifloraPall)或川赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)，为多年生草本植物，外表黑褐色无毛，根肥大、纺锤形或圆柱形；味苦、性微寒，归肝、脾经，有清热凉血、活血祛瘀的功效。赤芍为我国传统名花，素有“花相”的美誉，因其花型多样、花色多彩及气质典雅而有较高的园林观赏价值，广泛用于园林造景；主要分布于东北、华北、陕西及甘肃等地。赤芍喜光、湿润之地，对水分缺乏较敏感，而北方地区为赤芍主产区，多为干旱或半干旱地区，春季干燥、降水少，夏季炎热、干旱少雨造成水资源短缺，显著影响了赤芍的生长发育及产量[1]，可见，干旱是影响北方地区赤芍栽培的主要逆境胁迫因子[2]。

干旱抑制植物生长发育和细胞有丝分裂，降低细胞膨压，减弱细胞伸长和扩张能力，导致植物生长速度降低、植株矮细小、抽芽量减少、叶片枯黄皱缩且表面积减小以及根系发育不良等不可逆的生理损伤[3]。根系是吸收水分的主要器官，干旱胁迫下根系首先接收水分亏缺信号，通过根系肉质化、根皮变厚、增加侧根数量及根向下深扎程度及提高根冠比广泛吸收土壤深层水分等方式响应干旱胁迫，之后信号传递到其他器官[4]；干旱胁迫会影响植物的渗透调节、营养代谢、呼吸作用与光合作用等，尤其是叶片形态及部分生理特性，如细胞壁变厚、叶片皱缩变小、气孔下陷以及栅栏组织与海绵组织比值降低等；生殖阶段干旱胁迫影响种子数量、大小和成分，而且花数、结荚率、结实率等指标均显著下降，严重影响植株生殖。此外，植物体内很多基因直接参与对干旱胁迫的抵御，通过该类基因的表达调控减缓胁迫伤害以维持细胞的正常生理代谢，主要包括编码脱水反应元件结合蛋白(DREB)、MYB转录因子、WRKY转录因子、信号转导相关蛋白、抗氧化酶、渗透调节因子合成酶以及保护细胞结构的功能蛋白基因等[5-8]。

干旱胁迫是影响赤芍生长发育的主要逆境因子之一，涉及赤芍的每个生长发育阶段，并在发育完成后会继续影响赤芍的营养运输、吸收、光合作用与呼吸作用等生理代谢过程。我国约50%的土地为干旱或半干旱地区，南方由于偶发雨量不均或时空分布等原因也会引发季节性干旱[9]。部分药用植物在适度干旱胁迫下，不但能形成优良理化性质，还能固水防沙﹑保护生态，因此，探究药用植物抗旱性对了解、保护干旱地区生态系统和药用植物资源具有实践意义。目前全球水资源短缺，构建节水型绿化园林以及培育耐旱赤芍栽培种已是大势所趋[10]。有关赤芍干旱应答的抗旱生理指标动态变化报道较少，且对抗旱相关基因的表达调控及赤芍抗旱机制的研究亦相对薄弱。因此，为了阐明赤芍抗旱机制，本研究探讨了不同程度干旱胁迫下赤芍光合特性、叶绿素荧光参数等生理指标，以及相关基因(DREB、Psb27、PsaK、MDHAR、SOD、GR)的表达特征，旨在为赤芍抗旱品种选育及其在干旱、半干旱地区的栽培实践提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用盆栽控水法，2021年6月以5 a生赤芍盆栽苗(壤土∶粗砂∶泥炭=1∶1∶1)为试验材料，处理前将赤芍浇透水，后分为3组：轻度干旱(土壤相对含水量约为田间持水量的50%)、重度干旱(土壤相对含水量约占田间持水量的15%)；对照组(土壤相对含水量约为田间持水量的80%)。土壤田间持水量测定采用环刀法。每24 h采用称重法补充各盆栽的水分，盆栽混合土壤田间持水为100%时，土壤净含水量约为70%。分别在处理后的第0、4、8、12、16、20、24天取样检测生理指标；选择第15天的赤芍进行基因表达分析，每个试验均做3次生物学重复。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标检测 采用烘干称重法测定叶片相对含水量，取适量赤芍新鲜叶片，采用天平(0.0001 g, 美国OHAUS CP214)称鲜质量(FW)，100℃烘箱处理7 min，后65℃处理3 h，烘干直至恒重记为干质量(DW)，叶片相对含水量(%)=(FW-DW)/FW×100%。可溶性糖和可溶性蛋白检测分别采用可溶性糖试剂盒与可溶性蛋白试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)；每天上午9∶00采用便携式光合荧光测量系统(LI-6800，LI-COR公司，美国)内置光源(光照强度为1 500 μmol·m-2·s-1)对赤芍从下往上的第5片成熟叶片(每个处理采用相同部位叶片)测定光合速率(Pn)，蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)值；采用叶绿素试剂盒和胡萝卜素试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司)测定色素含量；采用植物激素脱落酸ELISA检测试剂盒(合肥莱尔生物科技有限公司)测定脱落酸(Abscisic acid，ABA)含量；采用磺基水杨酸法提取、测定赤芍叶片脯氨酸的含量[11-12]；采用硫代巴比妥酸(TAB)法提取、测定赤芍叶片丙二醛含量；采用GSH检测试剂盒和AsA检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定AsA-GSH循环系统酶活性[13-14]，每个处理重复3次取平均值。

1.2.2RpDREB基因RACE克隆 以罗勒(OcimumbasilicumL.)ObDREB基因序列(GenBank：KR136344.1)设计引物(表1)。取赤芍根、叶组织液氮研磨，按RNA提取试剂盒(EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit)说明书提取赤芍总RNA，采用分光光度计(UV 751GD)检测其纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；以赤芍总RNA为模板，按AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒(AMV first strand cDNA synthesis kit)合成赤芍cDNA第一链，-20℃保存用于后续RpDREB克隆模板。以赤芍cDNA第一链为模板，DREB-coreF/DREB-coreR为引物，克隆RpDREB核心序列[15]。反应体系20 μL，包含1 μL cDNA，0.6 μL dNTP Mix，0.8 μL 10 μmol·L-1上下游引物，(10×)Advantage®PCR 缓冲液2.0 μL，(50×)Advantage®聚合酶混合液0.8 μL，加ddH2O 至20 μL；反应程序：95℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，30个循环；72℃延伸10 min；采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(DiaSpin DNA gel extraction kit)回收PCR产物，连接pGM-T vector载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，将筛选的阳性克隆送至生工生物工程(上海)公司测序。采用5′-RACE 试剂盒和3′-RACE 试剂盒(SMARTer RACE cDNA amlification kit试剂盒)快速扩增克隆RpDREB核心序列的5′端和3′端，将获得的5′端和3′端赤芍RpDREB片段电泳、切胶纯化与测序，后采用DNAStar的SeqMan程序拼接5′-RACE、核心序列与3′-RACE序列，并以赤芍cDNA为模板，采用跨赤芍RpDREB基因开放阅读框(ORF)的RpDREB-F/ RpDREB-R为引物，扩增RpDREB基因，并测序验证是否与拼接序列一致。本研究共克隆6个赤芍干旱胁迫相关基因，以RpDREB克隆为例[16]。

1.2.3 基因表达分析 选择赤芍干旱应答元件结合蛋白DREB，光合作用相关蛋白Psb27(光系统ⅡPsb27蛋白)和PsaK(光系统Ⅰ亚基X蛋白)，抗氧化响应相关基因单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate reductase,MDHAR)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述蛋白干旱胁迫下的表达情况(引物见表1)。25 μL qRT-PCR反应体系，SYBRPremixExTaqⅡ(2×)5.5μL，10μmol·L-1上下游引物各1.5μL，ROX参比染料(50×)0.8 μL，cDNA模板1.8 μL，加ddH2O 至25 μL；反应程序：95℃预变性2 min；95℃变性50 s，60℃退火45 s，72℃延伸50 s，40个循环；每个样品3次生物学重复取平均值，采用2-ΔΔCt法进行上述基因表达水平的分析计算[17]。

表1 引物信息

1.2.4 数据统计与分析 采用Excel 2016和 DPS 7.05软件进行试验数据与差异显著性分析，采用SPASS 21.0与SAS/STAT进行方差分析，采用Duncan多重极差法进行检验(P<0.05)[18]。所有试验均采用完全随机设计生物学重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对赤芍叶片相对含水量的影响

叶片是对干旱胁迫反应最敏感的器官(图1)，轻度干旱与重度干旱胁迫4 d时赤芍叶片含水量保持一致，8 d后轻度干旱胁迫叶片含水量下降不明显，而重度干旱植株叶片含水量继续下降，12 d后，重度干旱植株叶片含水量显著低于轻度干旱胁迫植株和对照组，到第24天时，重度干旱胁迫下赤芍叶片含水量不足20%，而轻度干旱和对照组叶片含水量均高于55%。

注：数值为均值±标准差(SD)，小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)，下同。Note: The values is mean ± standard deviation (SD), and lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the same time (P<0.05), the same below.

2.2 干旱胁迫对赤芍叶片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响

可溶性糖与可溶性蛋白属于渗透调节物质，在持续干旱胁迫下，赤芍可通过提高二者含量来调控自身的含水量，达到维持植株正常生长发育的目的。结果显示(图2)，干旱胁迫促使赤芍叶片可溶性糖含量增加，重度干旱可溶性糖含量显著高于轻度干旱和对照组，在第16天重度干旱可溶性糖含量显著增加，而轻度干旱初期与对照组差异不显著，第12天后显著高于对照组；至干旱胁迫24 d，重度干旱和轻度干旱下赤芍叶片可溶性糖含量分别为对照的2.50倍和1.66倍。

图2 干旱胁迫对赤芍叶片可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影响Fig.2 Effects of drought stress on soluble sugar (A) and soluble protein (B) content of Radix paeoniae leaves

干旱胁迫下，赤芍叶片可溶性蛋白含量在干旱胁迫初期呈现明显的上升趋势，而后逐渐下降，但重度干旱和轻度干旱可溶性蛋白的含量均高于同期对照组。重度干旱胁迫第16天时，赤芍叶片可溶性蛋白含量显著上升达到峰值，为对照组的2.43倍，第20天时呈急剧下降趋势，而轻度干旱与重度干旱曲线趋势基本一致。

2.3 干旱胁迫对赤芍叶片光合参数的影响

与对照组相比，持续干旱胁迫抑制了赤芍叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，3个指标随胁迫时间的延长均呈下降趋势(图3)。轻度干旱胁迫下，赤芍叶片Pn、Tr和Gs均显著高于重度干旱胁迫；重度干旱胁迫下，Pn、Tr和Gs在初期与轻度干旱无明显差异，第8天后显著下降，第16天后，上述3个指标均已趋近于零；而细胞间隙CO2浓度(Ci)变化趋势与上述3项指标有显著差异，轻度干旱初期Ci与重度干旱和对照组无明显差异，第8天后逐渐上升，第12天下降，可能由于在第7天浇水的缘故，但Ci值始终低于重度干旱，而赤芍叶片在重度干旱下，其Ci值在第8天开始升高，在第12天呈直线上升趋势，第20天时Ci值显著高于轻度干旱胁迫(约2.21倍)和对照组(约2.76倍)。

图3 干旱胁迫对赤芍叶片光合特性的影响Fig.3 Effects of drought stress on photosynthetic characteristics of Radix paeoniae leaves

2.4 干旱胁迫对赤芍叶片色素含量的影响

干旱胁迫对植物光合作用影响较大，由于干旱胁迫促使植物进行光合作用时叶片的气孔导度(Gs)下降，CO2进入叶片受阻，致使光合效率下降，加之叶绿体中类囊体膜及其超微结构均受损伤，最终致使赤芍光合色素合成亦发生改变。如图4A所示，干旱胁迫条件下，赤芍叶片的叶绿素含量下降，明显低于对照组，其中重度干旱胁迫下叶绿素含量呈现先下降后升高的趋势，第16天降低到最低值，约为对照组的26%，为轻度干旱的33%，而后呈上升趋势；而干旱胁迫下，类胡萝卜素与类黄酮的含量均有不同程度的升高(图4B、图4C)，且显著高于对照组，其中重度干旱24 d时，赤芍叶片类胡萝卜素与类黄酮的含量分别约为对照组的1.8倍和1.4倍，约为轻度干旱的1.4倍和1.2倍。

2.5 干旱胁迫对赤芍叶片脱落酸(ABA)含量的影响

如图4D所示，持续干旱胁迫下，赤芍叶片ABA含量呈现先上升后下降的趋势，第14天时ABA含量达到峰值，14～20 d缓慢下降，20～24 d呈剧烈下降趋势，且略低于轻度干旱胁迫第24天的ABA含量；而轻度干旱胁迫下，赤芍叶片ABA含量初期与重度干旱与对照组无明显差异，第8天后呈缓慢而稳定上升趋势，但始终高于对照组ABA含量。

图4 干旱胁迫对赤芍叶片色素与ABA含量的影响Fig.4 Effects of drought stress on pigment and ABA content of Radix paeoniae leaves

2.6 干旱胁迫对赤芍根系脯氨酸与丙二醛含量的影响

脯氨酸(Pro)作为渗透调节物质在植物抵御干旱胁迫过程中发挥重要作用，与植物的水分吸收密切相关，而丙二醛(MDA)是植物在逆境条件下发生膜脂过氧化的重要产物之一，能够反映细胞膜的过氧化程度大小与植物抗逆能力，如图5所示，干旱胁迫下Pro和MDA在赤芍体内会大量积累，呈稳定上升趋势，重度干旱第24天时，Pro含量分别为轻度干旱与对照组的1.34倍和1.19倍；而MDA含量在干旱胁迫第16天时剧烈上升，到第20天时，分别为轻度干旱和对照组的1.7倍和2.98倍。

图5 干旱胁迫对赤芍根系脯氨酸与丙二醛含量的影响Fig.5 Effects of drought stress on proline and malonaldehyde content of Radix paeoniae roots

2.7 干旱胁迫对赤芍根系AsA和GSH含量的影响

AsA-GSH循环系统是植物体内清除活性氧自由基(ROS)的主要途径之一，逆境胁迫下，植物通过增加抗氧化剂含量和相关酶活性来提高AsA-GSH循环系统的效率以抵御不良环境。由图6可知，干旱胁迫下赤芍AsA和GSH 含量均呈先升后降趋势，始终高于对照组。重度干旱胁迫第16天，抗坏血酸(AsA)含量达到峰值，分别是轻度干旱与对照组的1.14倍和1.21倍，而后AsA含量显著下降，到第24天，约为对照组的1.11倍；与重度干旱相比，轻度干旱胁迫下，AsA变化相对较平缓(图6A)。谷胱甘肽(GSH)在重度干旱胁迫下呈先上升后下降趋势，但与AsA相比，GSH下降趋势较为平缓，第16天达到峰值，分别为轻度干旱与对照组的1.41倍和1.61倍，到第24天，约为对照组的1.49倍；而轻度干旱胁迫下的GSH始终处于缓慢上升趋势，到第24天，约为对照组的1.49倍(图6B)。

2.8 赤芍RpDREB基因的克隆与编码蛋白理化性质

通过RT-PCR与RACE技术结合扩增赤芍RpDREB基因，cDNA全长1189 bp，编码299个氨基酸(图7)，采用Blastx比对赤芍此片段编码的氨基酸，结果与较多植物DREBs基因具有较高的相似性，可达87%～98%，可见，试验成功获得赤芍DREB全长cDNA序列，即RpDREB基因。ProtParam预测RpDREB蛋白质分子式为C1419H2208N384O427S12，分子量约33.86 kD，等电点7.64，不稳定指数49.81，无信号肽，表明RpDREB为不稳定的分泌蛋白质。ProtScale分析RpDREB的平均亲水性为-0.519，疏水性氨基酸少于亲水性氨基酸，表明RpDREB蛋白为亲水蛋白。SOPMA预测赤芍RpDREB蛋白质二级结构具有丰富的无规则卷曲(64.44%)、α-螺旋(22.54%)、延伸链(11.27%)和β-转角(1.76%)。

2.9 干旱胁迫对赤芍叶片相关基因表达的影响

植物抗旱性是多信号转导途径以及多基因偶联控制的复杂反应，在分子水平上探究抗旱相关基因表达调控方式可更加明确赤芍的抗旱机制。本试验对赤芍进行轻度和重度干旱胁迫处理，分析赤芍干旱应答、光合、抗氧化响应基因表达水平的变化(图8)。干旱应答元件结合蛋白RpDREB基因表达量升高，重度干旱表达水平明显高于轻度干旱，第20天时，分别是轻度干旱与对照组的1.93倍和4.69倍；干旱胁迫后，光合相关基因Psb27和PsaK表达水平上调，其中重度干旱下光合基因的表达水平显著上调；干旱胁迫抑制了抗氧化响应基因MDHAR表达，在干旱处理后其表达水平明显下降，但重度干旱和轻度干旱下基因的表达水平差异不大，而抗氧化基因SOD和GR在重度干旱胁迫后的表达水平明显上调后下降，其中SOD较显著，第16天表达水平达到峰值，分别是轻度干旱与对照组的1.58倍和1.86倍，而后剧烈下降，到第24天时表达水平降到对照组的1.43倍，轻度干旱胁迫下SOD和GR基因表达水平呈稳定上升趋势。

3 讨 论

人类活动、全球持续变暖、土壤干旱与荒漠化加剧了非生物胁迫的发生率及程度，严重影响药用植物的生长发育，给农业生产造成损失。干旱胁迫下植物的形态与组织结构、干旱相关基因的表达等均有不同程度改变。本研究表明，干旱胁迫下赤芍叶片含水量降低，且重度干旱明显低于轻度干旱和对照组，这与卡德尔[19]报道的马铃薯、三叶草、西瓜、玉米研究结果一致。作为渗透调节物质，可溶性糖与可溶性蛋白含量受干旱胁迫的影响也较大，赤芍可溶性糖含量持续增加，加强了赤芍的渗透调节作用，可消除或修复赤芍植株由于环境干旱引起的应激损伤，这与干旱胁迫下马铃薯[20]、花棒[21]等植物可溶性糖积累趋势一致，而赤芍叶片可溶性蛋白呈先增后降的趋势，可能由于可溶性蛋白多为生物代谢的酶类，干旱胁迫初期，由于赤芍产生应激反应而使体内代谢酶的含量增加、酶活提高，致使赤芍叶片可溶性蛋白含量增加，后期由于持续干旱胁迫，第20天时呈急剧下降趋势，抑制了赤芍体内相关蛋白质合成，加之酶快速降解等因素导致赤芍可溶性蛋白含量先增加后显著降低，细胞内渗透物质增加是引起渗透势下降的一个关键因素，体内积累渗透调节物质以维持细胞含水量和膨压，以保证细胞生长、气孔开放和光合等生理过程的进行。除可溶性糖与可溶性蛋白外，脯氨酸(Pro)作为赤芍细胞质的主要渗透物质，干旱胁迫下其含量显著增加，脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及细胞内的代谢过程，干旱胁迫下蛋白质合成减慢，导致Pro参与蛋白质合成量减少，Pro积累直线上升，保持胞质内溶胶与环境的渗透平衡，防止细胞失水，增强蛋白质的可溶性并减少可溶性蛋白的沉淀，保护这些生物大分子结构和功能的稳定，干旱胁迫产生的氨亦可形成Pro，起到解毒作用；而MDA具有很强的毒性，是膜脂过氧化物作用的主要产物之一，是膜系统受伤害的重要标志，干旱胁迫下它能与膜上的蛋白质氨基酸残基或核酸反应生成shiff碱，增加膜透性。

植物光合参数会由于干旱胁迫生物量分配的变化而变化，如干旱胁迫初期，赤芍叶片的光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、细胞间隙CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)整体变化趋势一致，而持续干旱胁迫导致赤芍叶片的光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)均呈下降趋势，可见赤芍叶片Gs降低，偶联Pn和Tr均降低来抵御干旱胁迫，Gs和Tr仅在重度干旱胁迫初期出现急剧下降后缓慢上升的趋势，可能是前期重度干旱胁迫至16 d导致赤芍叶片气孔结构严重受损，后期干旱胁迫持续增强也无法做出应答反应；ABA对植物气孔运动和基因表达均具调控作用，干旱胁迫下赤芍ABA含量先增加后降低，这与王得运等[22]研究结果一致，可能赤芍为响应干旱胁迫，ABA含量迅速提高以调节气孔开度缓解干旱胁迫给赤芍带来的损害，但持续干旱ABA抵御重度干旱的调节机制降低，导致赤芍ABA含量减少；Ci值在重度干旱初期升高不明显，与对照组、轻度干旱处理差异不显著，在第12天呈直线上升趋势，其原因可能是干旱胁迫初期气孔开度降低但仍可消耗CO2进行光合作用，而持续胁迫致使气孔关闭，光合作用停止，赤芍叶片中CO2含量则剧烈积累增加，这与宋学贵等[23]研究的竹柳Ci变化趋势一致；干旱胁迫下赤芍叶片光合作用相关的基因Psb27和PsaK表达量均显著上升，表明干旱胁迫损伤了赤芍叶片叶绿体，减弱了光合作用。植株通过提高光合作用相关基因的表达水平以维持正常生长发育；此外，光合色素含量亦可直接影响赤芍的光合能力，干旱胁迫下由于活性氧(ROS)代谢失衡，叶绿素分解加速导致叶绿素含量呈线性下降，而赤芍叶片类胡萝卜素和类黄酮含量增加，可降低干旱胁迫叶绿素的伤害，增加赤芍叶片的抗性；为防止ROS 积累造成的细胞损害，植物进化出保护酶系统(SOD)和AsA-GSH 酶循环系统(GR)等有效抗氧化防御系统，赤芍通过增加酶活性来清除体内积累的ROS。干旱胁迫下，赤芍AsA-GSH循环系统酶活性和SOD以及GR基因表达水平均呈先升后降趋势，可能是由于干旱初期SOD正常合成，但持续干旱胁迫破坏了SOD合成酶的结构，造成SOD基因表达水平降低，这与董守坤等[24]和Wada等[25]研究结果一致。综上所述，干旱胁迫对赤芍植株的表型特征、生理特性、光合特性以及相关基因的表达水平等影响较为显著，且随着干旱胁迫程度不同，赤芍植株抗旱响应度亦存在较大差异。