上官玲玲，卢慧芳，夏会丽，陈雄，2，代俊，2，3，4*

1(湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉，430068)2(发酵工程教育部重点实验室(湖北工业大学)， 湖北 武汉，430068)3(工业发酵湖北省协同创新中心(湖北工业大学)，湖北 武汉，430068) 4(工业微生物湖北省重点实验室(湖北工业大学)，湖北 武汉，430068)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为革兰氏阳性菌，具有兼性厌氧、无芽孢、生长速度快、无致病性等特点。在20世纪50年代后近半个世纪被广泛用于各种L-氨基酸的大规模生产，如L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸等[1]。该菌株的实用性范围不断扩大，除了生产L-氨基酸外，还被用于生产有机酸、生物燃料、萜类化合物及芳香族化合物等[2]。目前该菌株已成为工业生产的模式微生物之一，被广泛用于微生物细胞工厂的构建。

为了提高谷氨酸棒杆菌的性能和生产效率，常采用新技术对菌株进行诱变、筛选和改造。如通过常压室温等离子体等新型诱变技术使菌株对环境的耐受性提高，同时菌株对底物的利用率及一些代谢物质增加；利用新型的高通量筛选技术加速菌株的开发及提高筛选效率；采用基因编辑技术实现有机酸、生物燃料、萜类化合物等一系列增值化合物的生产。因此，新技术的应用能促使谷氨酸棒杆菌成为最有希望的微生物细胞工厂之一[3]。

传统的谷氨酸棒杆菌发酵一般采用成本较高的淀粉类粮食为原料，在进行大规模工业化生产时不利于节约成本[4]。目前研究者采用合成和系统代谢工程的方法，以微生物为底盘细胞，利用可再生原料合成一些大宗或精细化学品，并通过驯化和基因改造等手段可进一步提高可再生原料预处理水解液中抑制物的耐受性，最终扩大菌株对纤维素等可再生资源底物的利用[5]。

本文针对谷氨酸棒杆菌新型诱变技术、高通量筛选技术、基因编辑技术及其高附加值产品的生产情况进行综述，并总结了高效的谷氨酸细胞工厂能利用可再生原料生产高附加值产品的实例，为研究构建多功能谷氨酸棒杆菌细胞工厂，利用新原料生产高附加值产品提高参考(图1)。

图1 谷氨酸棒杆菌多功能细胞工厂的构建[6]Fig.1 Construction of C.glutamicum multifunctional cell factory[6]

1 构建细胞工厂的新技术

1.1 新型诱变技术

诱变技术普遍应用于菌株选育，主要分为物理诱变、化学诱变和生物诱变等3大类[7]。传统的诱变技术如紫外诱变或使用化学诱变剂诱变等，存在安全风险和效率低等问题，制约着细胞工厂的发展。近年来，涌现出多种新型高效诱变技术例如常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、重离子辐射和复合诱变等(表1)。这些新型诱变工具与传统的诱变技术相比不仅安全可靠，还加速了微生物细胞改良效率。

表1 新型诱变技术在谷氨酸棒杆菌选育中的研究成果Table 1 Research results of novel mutagenesis techniques in the breeding of C.glutamicum

ARTP诱变技术是一种新型物理诱变技术。它在常温下发射高活性粒子浓度的等离子体射流作用于菌株，使细胞膜的结构改变并诱发细胞启动SOS修复机制，修复过程所产生的错配位点能使 DNA 序列显著变化，最终使菌株突变[8]。该技术操作方便、安全高效、条件温和、环境友好[9]，并能显著提高目标产物。ARTP诱变后谷氨酸棒杆菌能高产氨基酸或有机酸等，如孔帅等[10]以C.glutamicum23798为出发菌株经ARTP诱变后获得高产L-异亮氨酸的突变体，L-异亮氨酸在摇瓶中的产量为18.5 g/L，比原始菌株提高62.03%，且遗传性状稳定。该技术成为提高谷氨酸棒杆菌对酸、碱、温度、有毒副产物等耐受性的新手段。

重离子辐照是一种高效人工电离技术，该技术作用于生物体细胞时会发生物理能量转移、化学结构改变和生物学效应[11]。与传统的紫外线射线、γ射线或X射线的诱变技术相比，重离子辐照表现出损伤较低、突变广及突变效率高等优势，而且重离子辐照的深度及部位均能精确控制，使突变更具方向性[12]。随着核物理学的不断进步，重离子辐照技术在高等植物育种方面取得了较大的进展，也逐渐被用于谷氨酸棒杆菌性能改良，如杨阳[13]以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，利用12C6+离子束对其进行辐照诱变，经24孔板初筛和摇瓶复筛后获得一株谷氨酸高产菌株，产酸为90.25 g/L，较出发菌株提高9.1%。

复合诱变是一种通过物理、化学多因子组合的细胞诱变方法，一般是2种或以上物理或化学诱变因子结合。该技术具有基因突变类型丰富、突变范围广、变异稳定等特点，并能弥补不同诱变技术之间存在的缺陷。在微生物细胞工厂选育方面，单一的诱变手段所产生的基因突变相对单一，不能满足基因突变类型的丰富性和菌株变异的稳定性。复合诱变技术有利于打破单一诱变存在的局限性，已成为现代诱变技术的主流，在谷氨酸棒杆菌提高目标产物方面也得到了广泛应用[14]。

1.2 高通量筛选技术

传统的筛选技术需要进行人工分离、纯化及摇瓶培养等步骤，因繁琐、费力和低效制约着细胞工厂的发展进程[14]。先进的高通量筛选技术越来越多地应用于细胞工厂的有效构建，如基于颜色或荧光的激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)、以液滴流体为平台的液滴微流控分选(droplet-based microfluidic sorting，DMFS)及基于生物传感器的筛选等(表2)，在很大程度上提高了突变库中的筛选效率。

FACS是一种高通量筛选细胞内带有荧光物质的方法，它能在高达109个的突变体文库中快速筛选。例如，ZHANG等[19]在菌种经ARTP诱变之后，利用FACS监测谷氨酸棒杆菌中单细胞内L-丝氨酸的浓度，从而在1.2×105的诱变体文库中筛选出一株高产L-丝氨酸的菌株。因此，该技术适用于细胞膜或细胞内目标物的筛选。

DMFS是一种高通量筛选胞内外酶及代谢物的分选技术，其可以弥补 FACS 技术存在的不足，同时与传统的高通量筛选技术比较，更大程度上降低筛选成本和时间。基于DMFS技术新开发的微生物微液滴培养仪(microbial microdroplet culture system，MMC)，因具有自动化、微型化和智能化等优势而被广泛应用于细菌、酵母等单细胞微生物的筛选。该技术与诱变技术结合能更高效地获得目标菌株。如邓磊等[20]采用ARTP对出发菌株C.glutamicumATCC 14067进行诱变处理后，通过自动化的MMC系统结合平板选育具有组氨酸结构类似物的抗性菌株，然后经48孔板初筛及摇瓶复筛后得到一株L-组氨酸产量为(0.561±0.016)g/L的菌株，且稳定性良好。

表2 高通量筛选技术在谷氨酸棒杆菌选育中的研究成果Table 2 Research results of high-throughput screening technology in the breeding of C.glutamicum

在突变文库的筛选中，有些微生物在生产化学品时只有少部分能通过颜色或荧光的方法直接筛选，大多数化学物质本身不具有颜色或荧光，甚至不易于染色。因此，科研人员开发出通过特定的识别元件来响应胞内特定代谢产物浓度的生物传感器筛选技术，如以转录因子为识别元件构建的生物传感器响应技术，转录因子能结合基因的启动子独自或与其他蛋白组成复合体，使其促进或阻断RNA聚合酶参与转录过程来控制基因表达。细胞内的部分小分子代谢物能通过激活或者失活转录因子，控制相关基因的表达，从而将代谢物浓度与细胞生长等相关检测信号联系起来，达到高通量筛选的目的。目前，研究者利用转录因子开发响应不同代谢物的高通量筛选生物传感器，可以响应氨基酸、脂质、糖磷酸等代谢物。

1.3 基因编辑技术

20世纪90年代初，谷氨酸棒杆菌质粒的分离和第一代DNA编辑技术的开发成为了谷氨酸棒杆菌基因改造的里程碑。21世纪初，德国和日本的学者公布了ATCC 13032 模式菌株的全基因组序列，奠定了谷氨酸棒杆菌基因改造的基础[3]。截至2021年12月30日，美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)已收录74株全基因组测序的谷氨酸棒杆菌，包括C.glutamicumS9114、C.glutamicumATCC 13032、C.glutamicumATCC 14067等。基因组时代的到来，转变了科研人员依赖于诱变策略的育种模式，转而采用理性策略改造和重构微生物细胞工厂中的代谢和网络调控的方法[23]，加速了基因编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用和研究。

传统的基因编辑技术效率低、耗时长，主要依赖于同源重组手段对目的基因进行缺失、突变和插入。JGER等[24]开发sacB的谷氨酸棒杆菌基因缺失方法。TAN等[25]对这种基因编辑进行改进，成功构建了质粒pDXW-3，构建该质粒需要2步同源重组，耗时较长。HU等[26]基于Cre/loxP介导的特异性位点建立了谷氨酸棒杆菌基因缺失系统，该系统由pDTW109、pDTW201和pDTW202三个质粒进行基因组编辑，用于敲除谷氨酸棒杆菌的目的基因，但这种方法会在基因组位点留下残留序列。由此可见传统的基因编辑方法虽然能进一步提高筛选效率，但会影响微生物细胞工厂的构建。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)的新系统可以解决耗时和效率低的问题。CRISPR序列于1978年被日本学者发现，2007年法国科学家证实了CRISPR/Cas的Cas蛋白在病毒抵御过程中的作用[27]。CRISPR/Cas 系统包括Class I和Class II两大类，其中最新发展的Type II-CRISPR/Cas9因在设计和操作上简单、高效、易操作、成本低被广泛应用于微生物细胞工厂，如毕赤酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等。但研究发现CRISPR/Cas9 系统携带Cas9基因的质粒在谷氨酸棒杆菌中难以转化插入，说明该系统对谷氨酸棒杆菌有较大的毒性，需要通过严格调控Cas9蛋白降低毒性影响。CHO等[28]克服了该困难，通过对Cas9基因密码子进行优化，成功降低了Cas9表达对细胞的毒性，并将其应用于谷氨酸棒杆菌细胞工厂的基因改造(表3)。

表3 基因编辑筛选技术在谷氨酸棒杆菌中的应用Table 3 Application of gene editing and selection technology in C.glutamicum

2 谷氨酸棒杆菌细胞工厂生产高附加值产品的应用

2.1 有机酸

谷氨酸棒杆菌早期主要用于生产各类氨基酸。随着研究人员的不断开发，其已从氨基酸生产的宿主发展成为一个多功能细胞工厂，能生产有机酸(琥珀酸、乳酸、α-酮戊二酸等)、生物燃料(3-甲基-1-丁醇、异丁醇等)、萜类化合物(类胡萝卜素、香叶醇、朱栾倍半萜等)等多种产品(图2)。下面主要对这几类高附加值化合物的谷氨酸棒杆菌细胞工厂进行阐述。

有机酸是一类含有羧基的酸性化合物。可作为工业中的洗涤剂、硅影剂或食品的护色剂和防腐剂等。谷氨酸棒杆菌被认为是生产有机酸的菌株之一，通常在微氧或厌氧条件下合成琥珀酸、乳酸和α-酮戊二酸等化合物。

琥珀酸是重要的四碳平台化合物，最早于1993 年发现琥珀酸能在供氧不足的谷氨酸棒杆菌中大量积累[33]。随着科学的进步，研究者在谷氨酸棒杆菌合成琥珀酸方面进行了更深入的研究，OKINO等[34]通过过表达丙酮酸羧化酶的pyc基因，使L-乳酸脱氢酶的ldhA基因断裂，并在厌氧条件下采用流加NaHCO3和葡萄糖的方式积累146 g/L琥珀酸。夏慧华等[35]在厌氧下过表达sucE琥珀酸输出蛋白使琥珀酸得率和生产率分别提高7%和19%。研究者除了采用基因手段外，还结合关键代谢流提高琥珀酸产量，如CHUNG等[32]通过过表达NCgl0275下调解除终产物抑制使分批补料发酵的琥珀酸产量提高37.7%，达55.4 g/L，并进一步提高从磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的代谢流量，最终使琥珀酸产量达到152.2 g/L。

图2 谷氨酸棒杆菌细胞工厂高附加值产品的生物合成途径Fig.2 Biosynthetic pathways of high value-added products from C.glutamicum cell factories

除高产琥珀酸之外，谷氨酸棒杆菌也能同时大量积累乳酸和α-酮戊二酸等。如TSUGE等[36]利用代谢工程大量合成L-乳酸和D-乳酸，通过过表达糖酵解酶和葡萄糖激酶等6种酶的基因，使L-乳酸和D-乳酸浓度增加了146%和56%，再通过整合ED途径中关键基因，进一步使L-乳酸和D-乳酸浓度分别提高了11%和44%，最后L-乳酸和D-乳酸的产量分别高达212 g/L和264 g/L。TENHAEF等[37]通过对谷氨酸棒杆菌Weimberg途径的改造，使菌株WMB2evo在微氧条件下利用D-木糖生产α-酮戊二酸和琥珀酸，并通过补料分批工艺使α-酮戊二酸和琥珀酸产量分别为11.45 g/L和11.36 g/L。

2.2 生物燃料

生物燃料泛指由生物体组成或转化的固体、气体或液体燃料，被应用于食品、化工、医药等多个领域。在以微生物法生产生物燃料方面，以谷氨酸棒杆菌为底盘微生物已广泛应用于生产3-甲基-1-丁醇、异丁醇等生物燃料。

3-甲基-1-丁醇是一种清洁、绿色和可再生的高级链醇能源。目前，作为汽油的理想补充或可持续替代品具有独特的优势，如它能以任何比例与汽油混合甚至完全取代汽油，与生物乙醇相比具有更高的能量密度和更低的吸湿性，且无腐蚀性，利于长期储存。以谷氨酸棒杆菌发酵生产3-甲基-1-丁醇时，很多学者主要通过增强基因表达、扩增新基因功能或消除反馈抑制等增加通量的方法来构建高效生产3-甲基-1-丁醇的细胞工厂。ZHANG等[38]通过沉默谷氨酸棒杆菌中的aceE基因和敲除ldh基因，同时利用硫酸二乙酯对菌株进行诱变获得谷氨酸棒杆菌突变体，使突变体的3-甲基-1-丁醇产量达659 mg/L。为了进一步将碳通量更多地引入3-甲基-1-丁醇合成途径，还通过删除ilvE基因构建没有ilvE活性的工程菌，使菌株产量从659 mg/L提升至697 mg/L。VOGT等[39]通过突变ilvE基因的起始密码子来降低其在谷氨酸棒杆菌中高产L-亮氨酸的活性，并抑制ldhA基因，实现aro10和yqhD的过表达，使改造后的菌株生产3-甲基-1-丁醇时，产量高达2.76 g/L。

异丁醇是一种新型生物燃料，具有广阔的发展前景。研究发现，高细胞毒性是微生物法生产异丁醇面临的巨大挑战，而谷氨酸棒杆菌能耐受异丁醇，在好氧和厌氧条件下能成功地将前体物2-酮异戊酸转化为异丁醇，实现高效生产。目前已有学者通过代谢工程对谷氨酸棒杆菌进行改造，使其能利用葡萄糖高产异丁醇，为构建高效生产异丁醇细胞工厂提供了新思路[40]。SMITH等[41]在构建谷氨酸棒杆菌合成异丁醇的细胞工厂中，通过敲除异丁醇合成途径中的一系列基因，使丙酮酸进入异丁醇的通量进一步加大，最终使异丁醇的产量提高至 4.9 g/L。但以葡萄糖为碳源生产异丁醇时，因其成本高，不适用于工业化的大规模生产，朱年青等[30]对C.glutamicumATCC 13032进行改造，利用餐厨废弃物为原料制备生产异丁醇的细胞工厂，通过基因敲除和强化合成途径使异丁醇产量高达165 mmol/L。

2.3 萜类化合物

萜类化合物是一类以异戊二烯碳骨架作为基本单元的化合物及其衍生物，其功能多样、种类繁多，在医疗、食品、保健品等领域具有很高的应用价值。谷氨酸棒杆菌因其自身具有独特的优势可作为生产复杂萜类化合物的底盘微生物，可通过改造和优化其代谢途径来合成类胡萝卜素和香叶醇等萜类化合物[2]。

类胡萝卜素是一种四萜类化合物，广泛存在于自然界中，如虾青素、番茄红素和β-胡萝卜素等均属于类胡萝卜素。以谷氨酸棒杆菌为底盘微生物生产类胡萝卜素时，一般通过基因表达调控手段来实现类胡萝卜素的合成，HEIDER等[42]通过对类胡萝卜素生物合成途径进行基因工程研究，证明谷氨酸棒杆菌可以生产一系列不同的C40和C50类胡萝卜素。虾青素是一种C40萜类色素，可采用化学或生物手段合成，其中生物合成虾青素更为安全。研究发现，在谷氨酸棒杆菌中代谢合成虾青素前体物质的存在及其合成途径中关键基因的确定，为构建高产虾青素的细胞工厂提供了可能。番茄红素是一种常用于医药和食品等行业的萜类化合物，可对谷氨酸棒杆菌内含的萜类色素合成途径进行改造来合成大量番茄红素，如DOMINGUEZ等[33]通过删除谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的crtEb基因，使番茄红素积累到(0.03±0.01) mg/g，同时过表达crtE、crtB、crtI基因将番茄红素产量提高80倍，达(2.4±0.3)mg/g。

香叶醇是一种无环单萜类化合物，在香水和医药方面有很大的商业价值。在谷氨酸棒杆菌合成萜类化合物的代谢途径中，香叶基焦磷酸(geranylpyrophosphate，GPP)是单萜类化合物的前体，通过引入香叶醇合成酶转化成内源前体物GPP即可合成香叶醇。为进一步在谷氨酸棒杆菌中高产香叶醇，还需要通过引入合成香叶醇的相关基因来实现高产。如徐硕[43]以野生型C.glutamicumATCC 13032为出发菌株导入香叶醇合成基因，同时过表达了谷氨酸不棒杆菌中糖酵解途径的dxs和idi内源基因，使香叶醇产量从(5.38±0.38) mg/L提升至(12.18±0.44) mg/L。

3 谷氨酸棒杆菌细胞工厂利用可再生资源生产高附加值产品的实例

谷氨酸棒杆菌主要以富含糖和淀粉的小麦、马铃薯、玉米、木薯等粮食作物作为发酵原料。然而，这种传统的生产方法存在粮食竞争问题。可再生原料如秸秆、稻壳、枯草、甘蔗渣、木屑等非食品的农业废弃物，因其具有可重复生产，价格低廉，来源广泛等特点，被开发作为原料生产高附加值产品，扩大了细胞工厂的底物谱(图3)。

图3 谷氨酸棒杆菌细胞工厂利用可再生原料 生产高附加值产品的实例Fig.3 Example of C.glutamicum cell factory producing high value-added products from renewable raw materials

玉米秸秆、玉米芯和小麦秸秆等是常见的可再生农业废弃物，自身含有丰富的葡萄糖等营养物质，通过生物炼制过程可将其酶解或水解液作为发酵性糖用于生产高附加值产品。华珂君[5]以C.glutamicumS9114为出发菌株，通过引入来自蓝藻的酰基-ACP还原酶-醛去甲酰化加氧酶产烃途径成功构建1株具备产烃能力的菌株，同时将脂肪酸脱羧酶分泌表达途径与酰基-ACP还原酶-醛去甲酰化加氧酶产烃途径整合形成双烃途径的工程菌，并对其发酵条件优化后使烃产量提高81.3%，达29.1 mg/L。该菌株利用玉米秸秆水解液进行初步产烃时，产量达10.8 mg/L，实现了以木质纤维为原料发酵生产烃类化合物的目的。肖雁秋[4]通过对不同谷氨酸发酵菌株进行发酵性能的筛选，得到一株发酵性能较好的菌株C.glutamicumSⅡMB460，其自身能利用15%未脱毒的玉米秸秆水解液在青霉素诱导的条件下生产31 g/L的谷氨酸，产量和得率均可达到甚至超过合成培养基的水平。温经柏[44]以C.glutamicumS9114为出发菌株，通过对菌株进行多层次的代谢工程改造后解决了影响谷氨酸棒杆菌利用玉米秸秆水解液生产谷氨酸和γ-氨基丁酸的关键问题，最终得到的重组菌株在以玉米秸秆水解液为碳源的条件下，谷氨酸和γ-氨基丁酸的产量分别达65.2和39 g/L。李浩[45]以C.glutamicumKBJ07为出发菌株，通过在菌株中异源表达cod、p4h基因和敲除putA基因，构建合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(Hyp)的突变菌，突变菌株最高生产水平为310 mg/L，将其在玉米芯酶解液配制的发酵培养基中发酵时，表现出良好的利用玉米芯酶解液产酸的能力，Hyp产量高达327 mg/L。而潘浩等[46]研究了经代谢工程改造后的突变株以麦秸秆水解液为原料在厌氧条件下利用其阿拉伯糖或木糖合成34.1 mmol/L的琥珀酸，得率高于以葡萄糖为底物合成的琥珀酸。

4 结论

近几十年来，谷氨酸棒杆菌仍是氨基酸生物制造的核心菌种。如今新型的诱变技术、高通量筛选技术和基因编辑技术的快速发展，加速了谷氨酸棒杆菌作为微生物细胞工厂的构建和优化。谷氨酸棒杆菌在生产其他大宗化学品、天然产物、蛋白质、生物燃料等产品方面表现出高潜力和多功能性。此外，在代谢工程技术的发展推动下，谷氨酸棒杆菌的底物谱扩展到其他廉价和非食品竞争的可再生原料(如纤维素、乳浆、青贮及秸杆和麦麸的水解液等)，且菌株在这些原料中能同时利用多种碳源来生产各种高附加值产品，使谷氨酸棒杆菌成为一种有前途的高效工业平台菌株。

目前，菌株利用新原料生产产品的效率还有待进一步提高。因此，仍需借助系统的生物学手段全面分析谷氨酸棒杆菌的功能基因，并利用代谢工程继续挖掘其代谢潜力，使细胞工厂实现高产量、高速率和高纯度的目标。此外，预处理的原料不可避免地存在各种抑制物，抑制物浓度较高时影响菌株的生长，需进一步提高菌株在各种碳源的共同利用、增强高浓度产物或底物的耐受以及抑制物耐受等方面的能力，使其更适用于工业化生产。