朱逢麒,李少华,金岩,丁静忆,杨若男,蔡金贞

(青岛大学,山东 青岛 266003 1 附属医院器官移植中心； 2 基础医学院)

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)是慢性肝病的主要原因，世界卫生组织(WHO)估计全球超过2.5亿人患有慢性乙型肝炎(CHB)，占总人口的3.5%。每年有60万～100万人死于CHB并发症，造成了巨大的公共卫生负担[1-2]。中国的HBV感染负担是世界上最大的。我国乙肝相关肝病死亡率占全球的30%以上[3]。肝移植是目前临床上治疗多种非恶性和恶性终末期肝病的一种最有效方法[4]。由于移植术后乙肝复发的病人病情凶险，预后不佳，甚至会威胁病人生命，故肝移植术后防治乙肝复发是一项长期管理的策略[5]。而肝移植术后注射乙肝疫苗是防治乙肝复发的有效手段之一。肝移植受者术后接种乙肝疫苗，可有一定比例的病人产生具有保护作用的乙肝表面抗体(HbsAb)，并使受者建立对HBV主动免疫[6-7]。滤泡辅助性T(Tfh)细胞是一种CD4+T细胞亚群，在B细胞介导的免疫反应中起辅助作用[8-9]。Tfh细胞对抗体应答的发展至关重要，并与多种疾病发生发展密切相关[10]。本研究首次探讨了Tfh细胞亚群在肝移植术后HBV免疫应答中的作用，明确Tfh细胞各个亚群的表达及其对HbsAb产生的影响，以期为预防肝移植术后乙肝复发提供理论依据，为提高肝移植术后病人远期生存率提供治疗新手段。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2016—2019年，选取在青岛大学附属医院行肝移植手术的病人9例，男7例，女2例，年龄 (41～75) 岁，平均51岁。纳入标准：①有肝移植术史，②均因乙型肝炎导致的终末期肝病而行肝移植术，③肝移植术后全程接种乙肝疫苗3针，④全程接种后时间为2～3年。通过问卷调查获得接种记录中的年龄、性别、乙肝疫苗接种史等基本信息。纳入者根据抗体效价分为应答组(≥100 U/L)与未应答组(<100 U/L)，两组病人一般资料与相关血生化指标见表1。

1.2 研究方法

1.2.1流式细胞术检测Tfh细胞亚群的细胞频率用肝素钠抗凝管采集受试者的空腹肘静脉血5 mL，在室温条件下1 h内对血样进行处理。本实验采取的处理方法是Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，Fc受体阻断剂冰上避光孵育5 min，用T细胞染色抗体进行染色。分别选用APC/Cyanine 7 anti-human CD3、FITC anti-human CD4、PerCP/Cyanine 5.5 anti-human CD183(CXCR3)、APC anti-human CD185(CXCR5)和PE/Cy 7 anti-human CD196(CCR6) 等抗体对T细胞进行染色(圈门策略见图1)。所用抗体均为美国BioLegend公司的流式抗体。将Tfh细胞(CD3+CD4+CXCR5+)共分为3个细胞亚群，分别命名为Tfh1(CD3+CD4+CXCR3+CXCR5+CCR6-)、Tfh2(CD3+CD4+CXCR3-CXCR5+CCR6-)和Tfh17(CD3+CD4+CXCR3-CXCR5+CCR6+)。T细胞染色后，4 ℃避光孵育30 min，使用含有50 g/L BSA的PBS洗2次，每次5 min。弃上清，用PBS重悬，用流式细胞仪进行检测。使用Flow Jo software 进行分析。

图1 Tfh细胞及其亚群流式细胞术圈门策略

1.2.2ELISA法定量检测 使用人ELISA试剂盒(RENJIEBIO)对肝移植术后乙肝疫苗接种病人的HBsAb进行定量测定。对所有病人标本进行一式两份的检测。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 外周血Tfh细胞分布比较

流式细胞术检测Tfh细胞频率结果表明，应答组病人Tfh在淋巴细胞中的细胞频率为(6.53±0.67)%，未应答组为(4.94±0.28)%，二者比较差异有统计学意义(t=2.371，P<0.05)。应答组Tfh在CD4+T细胞中的细胞频率为(22.77±2.33)%，未应答组为(16.17±1.42)%，二者差异有统计学意义(t=2.534，P<0.05)。提示肝移植术后乙肝疫苗应答者组的Tfh细胞频率显著高于未应答者组，而且两组Tfh在淋巴细胞和CD4+T细胞中的细胞频率有显著性差异。见图2。

a：Tfh在两组淋巴细胞中分布的流式细胞术检测；b：Tfh在两组淋巴细胞和CD4+T细胞中细胞频率分布的比较。

2.2 外周血Tfh细胞不同亚群的分布

外周血Tfh细胞不同亚群分布的检测结果表明，Tfh2在应答组Tfh中的细胞频率为(22.54±2.37)%，未应答组为(24.68±1.22)%，二者差异无统计学意义(t=0.853，P>0.05)。提示肝移植术后乙肝疫苗应答组病人Tfh2细胞频率无明显变化。Tfh1在应答组病人Tfh中的细胞频率为(16.03±0.91)%，未应答组为(11.96±0.95)%，二者差异具有统计学意义(t=3.038，P<0.05)。提示肝移植术后乙肝疫苗应答者组的Tfh1细胞频率显著高于未应答者组。Tfh17在应答组Tfh中的细胞频率为(32.17±1.70)%，未应答组为(40.53±1.36)%，二者差异具有统计学意义(t=3.872，P<0.05)。提示肝移植术后乙肝疫苗应答者组的Tfh17细胞频率显著低于未应答者组。见图3。

2.3 外周血Tfh细胞亚群与HBsAb的相关性

相关分析结果显示，肝移植术后乙肝疫苗应答者组HBsAb抗体滴度与Tfh1和Tfh17细胞频率的比值呈正相关(r=0.982，P<0.05)，与Tfh2细胞频率无显著相关性。见图4。

图4 Tfh1/Tfh17与HBsAb滴度的关系

3 讨 论

Tfh细胞在疫苗免疫应答中的作用与其在病原体感染中是一致的[11-12]。了解Tfh细胞对疫苗的高亲和力成熟抗体产生的作用，以及对疫苗长期记忆的作用，对于改进未来的疫苗具有重要意义。

Tfh细胞表达趋化因子受体CXCR5，CXCR5引导它们迁移至B细胞滤泡[13]。Tfh细胞及其前体分泌的白细胞介素21(IL-21)能有效地促进B细胞的增殖和分化[14]。Tfh细胞分化的过程通常从幼稚的CD4+T细胞与抗原提呈细胞(APC)的相互作用开始，如树突状细胞(DC)。而是否分化成为Tfh细胞是在前两个细胞周期决定的[15]。Tfh细胞作为CD4+T细胞的一个特殊亚群，可以根据趋化因子受体的表达进行分类。CXCR3和CCR6是用于确定Tfh细胞亚群的特征性受体。Tfh细胞可以根据细胞表面表达的趋化因子进一步划分为亚群。已有研究将CXCR3+CCR6-Tfh细胞定义为Tfh1细胞，表达转录因子T-bet，分泌细胞因子IFN-γ；CXCR3-CCR6-Tfh细胞称为Tfh2细胞，表达转录因子GATA3，分泌细胞因子IL-4、IL-5和IL-13[16]；CXCR3-CCR6+Tfh细胞称为Tfh17细胞，表达转录因子ROR-γ并分泌细胞因子IL-17A和IL-22[17]。Tfh细胞在免疫反应中对于B细胞的辅助是抗体产生中的重要一环。在Tfh细胞分化的早期，其迁移到T-B边界并与抗原特异性B细胞相互作用。如果B细胞无法得到Tfh细胞的辅助，大多数B细胞的免疫功能都不能发挥；在没有得到T细胞辅助的情况下，B细胞很可能在抗原识别过程中的前24 h内死亡[18]。B细胞在竞争早期与Tfh细胞的相互作用取决于其本身的细胞频率及抗原亲和力[19]。而低亲和力的B细胞可能无法参与免疫反应，这对于疫苗的研究很有意义，因为其中针对某些病原体的特异性B细胞可能是相当罕见和低亲和力的[20]。而竞争失败的低亲和力B细胞无法对病原体产生免疫反应，最终导致机体对疫苗注射后的应答失败。这可能是之后疫苗的开发与研究的作用靶点之一。

本文研究结果显示，应答者组病人的Tfh细胞频率显著高于未应答者组，而且Tfh在淋巴细胞和CD4+T细胞中的细胞频率存在明显差异，提示肝移植术后乙肝疫苗接种者体内HBsAb的产生可能依赖于Tfh。而近年来有研究表明，在健康人群注射乙肝疫苗后第7天，HBsAb滴度和Tfh细胞频率同样呈正相关[21]。这与本文结果相一致。

Tfh细胞的主要任务是辅助B细胞诱导抗体反应。因此，辅助功能的评估对于理解外周血Tfh细胞亚群的生物学功能至关重要。本文研究结果表明，应答组外周血Tfh和Tfh1细胞频率明显高于非应答组，而外周血Tfh17细胞频率明显低于非应答组，两组外周血Tfh2细胞亚群的细胞频率比较无显著差别。同时，肝移植术后乙肝疫苗接种者应答组体内HBsAb滴度与Tfh1/Tfh17比值呈正相关。提示在肝移植术后乙肝疫苗接种者中，HBsAb的产生依赖于外周血Tfh1的细胞频率，而Tfh1与Tfh17细胞频率比值的偏移同样可能影响HBsAb的产生。外周血Tfh2和Tfh17细胞能够通过分泌IL-21辅助初始B细胞(naïve B)增殖分化，而外周血Tfh1细胞辅助naïve B细胞的能力有限[22]，这些结果已经得到其他研究的证实[15]。此外，外周血Tfh2细胞可促进IgG和IgE分泌，外周血Tfh17细胞能有效地促进IgG与IgA的分泌。因此，外周血Tfh2和Tfh17细胞可以辅助B细胞发挥作用。然而，在一些特定条件下外周血Tfh1同样拥有辅助B细胞的能力。有研究表明，在佛波酯(PMA)和离子霉素刺激下，外周血Tfh1细胞表达IL-21的水平与外周血Tfh2和Tfh17细胞相当[23]。这也许是肝移植术后乙肝疫苗接种者HBsAb应答率受Tfh1与Tfh17细胞频率的影响，且应答率不理想的原因。一项季节性流感疫苗研究显示，在接种第7天，外周血Tfh1细胞亚群增加与抗体反应的产生相关。这表明目前的流感疫苗在很大程度上依赖于Tfh1亚群，而流感疫苗的效果同样不理想[24]。

本次实验仅可提示外周血Tfh及其亚群的表达能影响肝移植术后乙肝疫苗接种者体内抗体的产生。而Tfh介导的信号通路是如何影响肝移植术后HBsAb产生的免疫学机制，仍需进一步从分子、细胞水平进行阐述。未来仍需探究Tfh细胞亚群分泌的细胞因子与肝移植术后乙肝疫苗接种者B细胞及抗体产生的关系。综上所述，在肝移植术后乙肝疫苗接种人群中，外周血Tfh细胞亚群的表达可能影响体内HBsAb的生成。