范晓凡, 刘 勇, 谭新球，张战泓, 张 卓, 史晓斌,*, 张德咏,*

(1. 湖南大学研究生院隆平分院, 长沙 410125; 2. 湖南省农业科学院植物保护研究所, 长沙 410125;3. 湖南省农业科学院蔬菜研究所, 长沙 410125)

根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)最新发现，自然界中存在9 110种病毒，其中全球目前已报道的植物病毒约2 129种，许多植物病毒能够专一性地感染农作物，对农林生产造成了严重的损失。由于植物细胞壁屏障的存在，病毒无法直接感染植物，只能依赖于昆虫介体的行为来实现其在宿主间的传播(Whitfield and Rotenberg, 2015; 关桂静等, 2017)。病毒对于昆虫的影响可以分为直接影响和间接影响，前者是病毒与媒介结合后对介体昆虫生理生化和行为的影响(施艳等, 2013; Blanc and Michalakis, 2016)，如:水稻矮缩病毒(rice dwarf virus, RDV)可以提高黑尾叶蝉Nephotettixcincticeps的存活率和产卵量，并促进种群的增长(王前进等, 2018);番茄黄化叶曲病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)可以促进烟粉虱Bemisiatabaci的取食行为，增加刺探与取食频率(Jahanetal., 2014)，从而促进病毒的传播。后者是指病毒的侵染可触发寄主植物的应激反应，进而在一定程度上影响介体昆虫，以此改变介体昆虫的生态适应性,如:芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus, TuMV)可以导致植物胼胝质沉积堵塞筛管的能力下降，从而有利于绿色桃蚜Myzuspersicae繁殖(Casteeletal., 2015);苹果感染植原体CandidatusPhytoplasmamali后释放大量的石竹烯，更容易吸引木虱(Mayeretal., 2008)。病毒依赖介体昆虫进行传播，病毒对植物的侵染又可以对介体昆虫产生影响，因此在植物病毒-介体昆虫-寄主植物三者间形成了复杂的互作关系，其中寄主植物介导介体昆虫与病毒的互作可能是决定田间病害流行的重要原因(Stoutetal., 2006)。

番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)最早在美国佛罗里达州被发现，感病植株症状表现为叶脉间的褪绿黄化，叶缘卷曲，首先于下部叶片观察到症状。发病严重时，整棵植株死亡，果实受到严重影响(Wintermantel and Wisler, 2006)。ToCV是一种韧皮部限制病毒，主要通过介体昆虫烟粉虱以半持久非循环方式传播(Polstonetal., 2014)，其寄主范围非常广泛，包括25科85种双子叶植物，其中包括非常重要的经济作物番茄、南瓜、辣椒等(Fiallo-Olivé and Navas-Castillo， 2019)。由于MED烟粉虱的适应性能强、寄主范围广、繁殖能力强，现已在全球范围内分布广泛，对全世界的农林经济作物生产造成了严重的影响(Fontetal., 2004)。目前关于ToCV的分子特征，烟粉虱传播ToCV的方式与特性已经做了充分的报道(Shietal., 2018; Weietal., 2019)，研究表明MED烟粉虱具有较强的获毒和传毒能力，但是对于ToCV暴发流行的原因尚不清楚，在烟粉虱携带病毒后，病毒对烟粉虱在不同寄主植物上的寄主选择性和取食行为的影响仍缺乏研究。

为此，本研究将通过Y型嗅觉仪探究携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱对于ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆以及ToCV非寄主棉花的选择趋向性差异，利用EPG技术比较携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱在4种植物上的取食行为，揭示烟粉虱携带ToCV后在不同寄主植物间的选择和取食行为差异，为深入研究烟粉虱-寄主植物-病毒三者间的相互关系奠定基础，也为有效控制ToCV的传播提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试虫源：MED烟粉虱，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员课题组馈赠。MED烟粉虱种群长期饲养在温度25～28℃、相对湿度60%～80%、光周期16L∶8D的温室内，以棉花为寄主继代饲养。将初羽化的MED烟粉虱用微虫笼夹至感染ToCV的番茄上获毒48 h，获得携带ToCV的烟粉虱雌成虫。

1.1.2供试毒源：单独侵染ToCV(GenBank登录号: KC887999.1)的番茄采自山东寿光，并且经过PCR以及小RNA测序检测无其他病毒复合侵染。将毒株移栽至湖南省农业科学院植物保护研究所温室，在不同隔间中单独培养，分别采用虫传的方法获取毒株。

1.1.3供试植物：茄科植物：番茄Lycopersiconesculentum(钻红美娜)、辣椒Capsicumannuum(新选益都红)；豆科植物：豇豆Vignaunguiculata(盈豇888)；锦葵科植物：棉花Gossypiumspp. (中棉所63)。 将供试种子播种于育苗盆中，放至于温度26±1℃、相对湿度60%～80%、光周期14L∶10D的温室内培育至发芽，随后将发芽的植株移栽到花盆中进行培养。花盆均用100目纱网封盖，避免烟粉虱及其他害虫污染寄主植物，保证植株的健康生长。

1.2 MED烟粉虱雌成虫对寄主植物选择行为的生物测定

用Y型嗅觉仪测定MED烟粉虱雌成虫对4种植物的趋性行为反应，将处于同一长势的棉花、番茄、豆角和辣椒分别放入4个味源瓶中，两两进行组合，每个玻璃臂通过硅胶管分别与气体流量计、味源瓶、活性碳、空气泵相连。打开气阀通气4 h后，取饥饿处理2 h的100头未携带ToCV烟粉虱成虫，将其引入Y型管的管柄中，用锡箔纸盖住进行避光处理，控制管中气体流速在400 mL/min，每30 min观察一次。烟粉虱进入Y型管管柄2/3处可视为选择，待2/3的烟粉虱选择完毕后，记录两个管柄内做出选择的烟粉虱数量。同时，取100头饲毒48 h的烟粉虱成虫，将其引入Y型管的管柄中，按以上方法测试携带ToCV烟粉虱对4种植物的取食偏好性。每次测定后需更换Y型管，消除误差，实验重复6次。实验在平均温度为(25±1)℃，相对湿度60%～80%的安静房间中进行。

1.3 EPG技术分析MED烟粉虱雌成虫在4种寄主植物上的取食行为

利用DC-EPG Giga-8(荷兰瓦赫宁根大学)刺吸电位技术监测携带和未携带ToCV烟粉虱口针在健康的ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆与ToCV非寄主棉花上的取食行为差异。将初羽化2-5 d的供试烟粉虱雌成虫饥饿处理2 h后，将其放置于生物冰袋上短暂麻醉后迅速将一段2～3 cm、直径12.5 μm的金丝一端粘连在烟粉虱的前胸背板上，另一端与EPG工作传感器的铜线粘连，同时将植物电极插入植株生长的土壤中。当烟粉虱口针刺入植株组织时，回路接通，电流信号经电流放大器放大后，由转换器将其转换成数字信号，再由STYLET软件(荷兰瓦赫宁根大学)记录并以波形数据的形式储存在计算机中。每头烟粉虱记录8 h，每次记录结束后，更换新的植物和烟粉虱。携带ToCV和烟粉虱对于番茄、辣椒和豇豆以及棉花的取食行为各测定15头成虫。实验在平均温度25±1℃，相对湿度60%～80%的安静房间中进行。

1.4 数据分析

应用统计软件为SPSS16.0。采用单因素ANOVA比较分析携带和未携带ToCV的MED烟粉虱对4种健康寄主植物的选择偏好性；绘图采用SigmaPlot 12.0。

EPG数据记录和波形识别使用EPG style+a与EPG style+d软件(Giga-8 DC-EPG系统，荷兰瓦赫宁根大学)，根据汤清波等(2011)标准对np, C, pd, E1, E2和G波6种波形进行归纳统计；分析前先检测数据的方差齐性和正态性，若符合正态分布，则采用T检验比较分析携带和未携带ToCV烟粉虱的取食差异；不符合正态分布的数据用log10转换。

2 结果

2.1 ToCV对MED烟粉虱雌成虫寄主选择行为的影响

通过Y型嗅觉仪对烟粉虱雌成虫的寄主选择行为进行测定，所得结果如图1。对于未携带ToCV的烟粉虱雌成虫，辣椒和番茄的引诱力最强；其次是棉花；豇豆的吸引力最弱。当烟粉虱成虫携带了ToCV，再对这4种植物进行选择时，选择番茄、辣椒的烟粉虱数量仍然是最多的，豇豆对其吸引力仍然是最弱的；但是与未携带ToCV的烟粉虱(对照)相比，携带ToCV的烟粉虱对番茄、辣椒分别与其他植株进行选择时，选择最喜爱的番茄与辣椒的烟粉虱数量显著减少(P<0.05)；对棉花与番茄、辣椒分别进行选择时，选择棉花的烟粉虱的数量没有显著变化(P>0.05)；对棉花和豇豆进行选择时，选择棉花的烟粉虱的数量出现显著减少(P<0.05)；对豇豆与番茄、辣椒进行选择时，选择豇豆的烟粉虱的数量没有显著变化(P>0.05)；对豇豆与棉花进行选择时，选择豇豆的烟粉虱的数量出现显著增加(P<0.05)。

图1 携带ToCV和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫对4种寄主植物的选择

2.2 携带ToCV的烟粉虱雌成虫取食行为的变化

2.2.1在ToCV寄主上取食行为的变化：在ToCV寄主番茄、辣椒和豇豆上，携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫非韧皮部取食行为EPG实验结果如表1, 3和5。携带ToCV的烟粉虱雌成虫在番茄、辣椒和豇豆上的总刺探次数显著高于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)，但是总刺探时间显著短于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)，C波(非韧皮部取食)总时间均无显著差异(P>0.05)，而携带ToCV的烟粉虱雌虫第1次刺探到第1次E波(韧皮部取食)出现时间在三者上都有明显的推迟，显著晚于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)；但是携带ToCV的烟粉虱与未携带ToCV的烟粉虱雌虫相比在番茄和豇豆上的第1次刺探发生时间显著提前，而在辣椒上的第1次刺探发生时间无显著差异(P>0.05)。携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫对番茄、辣椒和豇豆的韧皮部的取食行为EPG实验结果如表2, 4和6。携带ToCV的烟粉虱雌虫在番茄、 辣椒和豇豆上的E1波 (韧皮部分泌唾液)总时间、 E1波数量、 E1波平均时间、E2波数量与未携带ToCV的烟粉虱雌虫相比均无显著差异(P>0.05)，但是携带ToCV的烟粉虱雌成虫的E2波(韧皮部吸食汁液)总时间与未携带ToCV的烟粉虱相比显著减少(P<0.05)，E波潜在指数也显著降低(P<0.05)；而携带和未携带ToCV的烟粉虱雌成虫在番茄和豇豆上的E2波平均时间无显著差异(P>0.05)，在辣椒上的出现了显著的减少(P<0.05)。

表1 携带ToCV与未携带ToCV的 MED烟粉虱雌成虫在番茄植株上取食的非韧皮部的EPG参数

表2 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在番茄植株上取食的韧皮部的EPG参数

表3 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在辣椒植株上取食的非韧皮部的EPG参数

表4 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在辣椒植株上取食的韧皮部的EPG参数

表5 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在豇豆植株上取食的非韧皮部的EPG参数

表6 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在豇豆植株上取食的韧皮部的EPG参数

2.2.2在ToCV非寄主上取食行为的变化：在ToCV非寄主棉花上，携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫非韧皮部取食行为EPG实验结果如表7。携带ToCV的烟粉虱雌成虫在棉花上的总刺探次数显著高于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)，总刺探时间显著短于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)，而C波总时间在两者间均无明显差异(P>0.05)，携带ToCV的烟粉虱雌虫第1次刺探到第1次E波出现时间都存在明显的推迟，显著晚于未携带ToCV的烟粉虱的(P<0.05)；对于第1次刺探发生时间，携带ToCV的烟粉虱与未携带ToCV的烟粉虱相比在棉花上则没有显著差异(P>0.05)。在ToCV非寄主棉花上，携带和未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫的韧皮部的取食行为EPG实验结果如表8。携带ToCV的烟粉虱雌虫在棉花上的E1波总时间、E1波数量、E1波平均时间、E2波数量与未携带ToCV的烟粉虱雌虫均无显著差异(P>0.05)，但是携带ToCV的烟粉虱雌成虫的E2波总时间和平均时间与未携带ToCV的烟粉虱相比都显著减少(P<0.05)，E波潜在指数也均显著降低(P<0.05)。

表7 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在棉花植株上取食的非韧皮部的EPG参数

表8 携带ToCV与未携带ToCV的MED烟粉虱雌成虫在棉花植株上取食的韧皮部EPG参数

3 讨论

ToCV是一种在全球范围内引起严重作物病害的植物病毒，它的传播依赖于昆虫介体烟粉虱。传播病毒的过程分为获毒、持毒和传毒3个过程(史晓斌等, 2012)，当介体昆虫获取了一定量的病毒粒子后，它必须将病毒粒子转移到新的寄主上才能完成传毒，完成病毒在未被侵染寄主间的扩散。因此，介体昆虫对寄主的选择行为变化直接影响着病毒的传播，直接关系到病毒最终的扩散范围(Gandon, 2018)。大量研究表明，无毒的介体昆虫与携带病毒的介体昆虫在对于健康植株和感病植株选择中存在明显的差异，通常表现为无毒的介体昆虫趋向于选择带毒植株，而带毒的介体昆虫则趋向于选择健康植株或者没有明确趋向(Eigenbrodeetal., 2018)，这种趋性的改变将扩大寄主的范围，加剧病毒的传播。如有研究发现植物病毒能够通过一种类似炎症的免疫信号，级联激发介体昆虫烟粉虱脑部产生Caspase依赖的凋亡性神经退行，削弱其嗅觉和视觉的辨别能力，增强了带毒昆虫对于健康寄主的趋向，有利于病毒的传播(Wangetal., 2020)。本研究结果发现当烟粉虱雌成虫未携带ToCV时，它对于番茄和辣椒的选择性最强，这是由于番茄和辣椒的挥发物中存在吸引烟粉虱的物质。当烟粉虱雌成虫携带了ToCV时，病毒会影响烟粉虱对外界信息的辨别能力，因此它对于喜食的番茄、辣椒趋向性减弱，这将促有助于烟粉虱尽快转移寄主，将病毒传播出去。同时，本研究结果(图1)表明，病毒侵染可以增强烟粉虱对本来具有弱选择性的ToCV寄主豇豆的选择，这将导致烟粉虱定殖的随机性增大，从而增加了病毒在植物间的扩散机会；通过间种烟粉虱非嗜好植物来对其进行驱避的作用也会大大降低，增加了烟粉虱与病毒在田间流行的几率。

介体昆虫的取食行为直接影响着病毒的获取与传播，因此病毒对于介体昆虫取食行为的影响直接决定着病毒传播的效率。对于ToCV这种非循环性病毒而言，介体昆虫的获毒与传毒过程均在较短时间内完成，因此刺探取食次数的增加、频繁地更换取食位点和寄主转移对于它来说更为有利和高效(Maucketal., 2016; 王世藩等, 2020)。Moreno-Delafuente等(2013)发现TYLCV可以通过操控烟粉虱的行为来促进自己的传播，如影响烟粉虱对于寄主的选择，加强烟粉虱的刺探及取食行为；Wang等(2015)对蚜虫唾液中的血管紧张肽转化酶(angiotensin-converting enzymes, ACEs)进行研究发现，ACE1基因和ACE2基因的同时敲除会增强蚜虫取食能力，它能够很快地刺探到寄主的韧皮部；周涵宇等(2018)发现将褐飞虱Nilapawatalugens相关的唾液蛋白基因干扰后，在取食水稻的6 h内，褐飞虱韧皮部取食的时间明显缩短，部分干扰目的基因后的褐飞虱无法成功取食到韧皮部，这说明当病毒侵染介体昆虫时，可能是通过抑制或者促进了某些基因的表达，从而对介体昆虫的取食行为造成影响。

本研究通过EPG测定发现携带ToCV的烟粉虱雌成虫与未携带ToCV的烟粉虱雌成虫相比，在ToCV寄主番茄、辣椒、豇豆与ToCV非寄主棉花上刺探取食的总刺探次数显著增多；同时，第1次刺探到韧皮部的时间显著推迟，对韧皮部吸食汁液的时间(E2波总时间)与总刺探时间显著减少(表1～8)。尽管有研究表明，金丝的存在会影响烟粉虱的取食行为，12.5 μm的金丝与5 μm的铂丝相比，金丝的存在会显著增加烟粉虱的刺探次数，减少对韧皮部的取食时间(Chesnais and Mauck, 2018)，但是本研究所有的处理均采用粗细一致的金丝，意在探究ToCV病毒对于烟粉虱取食行为的影响，在分析时可以忽略金丝对于烟粉虱取食的影响。结果中在ToCV寄主上刺探次数的增加表明带毒烟粉虱在到达植物皮部取食过程中可能会遇到更多阻碍，从而需要更多的刺探尝试，这会提高病毒的传播效率；而韧皮部分泌唾液时间的推迟与取食时间减少也可能促使烟粉虱对现有寄主的取食情况感到不满足，从而促使它反复寻找新的宿主，这有利于病毒的传播与流行。在ToCV非寄主上取食行为的变化与在ToCV寄主上的一致，说明病毒是直接影响了烟粉虱从而导致取食行为发生了变化，通过影响介体昆虫、操控它的取食行为来促进自身的传播。而在这4种不同的寄主植物上，烟粉虱携带病毒前后的第一次刺探开始的时间变化并不一致，这说明第一次刺探时间可能还会受寄主植物的叶片结构影响，导致有些刺探时间明显提前，而有些显著推后。无论病毒对介体昆虫的直接、间接的影响都是来促进自身的传播的，若能够掌握昆虫体内病毒受体的特性，研究出能够阻碍受体与病毒的结合的物质，这将对控制病毒的传播有重大意义。