陈佳敏 刘永杰 马锦绣 李丹 公杰 赵昌平 耿洪伟 高世庆

（1.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；2.北京市农林科学院杂交小麦研究所，北京 100097）

表观遗传修饰由DNA甲基化、非编码RNA、染色质重塑和组蛋白修饰组成，对植物发育、胁迫相关基因的表达具有重要调控作用［1］。组蛋白修饰主要发生在组蛋白尾部和核心区的残基上，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化等修饰［2-3］，这些修饰共同构成“组蛋白密码”，并作用于染色质修饰过程［4-5］。组蛋白甲基化（histone methylation，HMT）主要发生在组蛋白赖氨酸或精氨酸残基上，根据作用位点和底物的不同可以分为赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferases，HKMTs）和蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）。 赖氨酸甲基化由赖氨酸甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为供体将甲基转移到赖氨酸的δ-氨基上，大多数HKMTs包含一个由130-150个氨基酸组成的保守结构，即SET结构域（用于variegation3-9的抑制因子，zeste的增强因子和trithorax）［6-7］。根据序列同源性和系统发育关系，将植物SDG蛋白分为7类，分别是E（Z）同系物（H3K27）、ASH1同系物（H3K36）、Trx同系物及相关蛋白（H3K4）、含有SET和PHD结构域的蛋白、SU（var）同系物、含中断SET结构域的蛋白、RBCMT和其他SET相关蛋白［8］。精氨酸甲基化由精氨酸甲基转移酶以SAM为供体将甲基转移到精氨酸胍基的氮原子上。根据生化特性的不同，精氨酸甲基转移酶可分为4类［9］：第一类PRMT修饰精氨酸侧链的ω-N形成单甲基（monomethy-larginine，MMA）和不对称双甲基（asymmetric dimethylarginine，aDMA）；第 二 类PRMT修饰精氨酸侧链的ω-N形成单甲基和对称型双甲基（symmetric dimethylarginine，sDMA）；第三类PRMT蛋白修饰精氨酸侧链的ω-N仅能形成单甲基；第四类PRMT蛋白修饰精氨酸侧链的δ-N形成单甲基［10-11］。

组蛋白甲基化在生物体细胞增殖、信号传导、基因转录调控等方面发挥着重要作用［12］。研究证明，组蛋白修饰通过调控基因表达参与逆境胁迫［13-15］。在植物干旱胁迫中，拟南芥TRX家族中的ATX1发挥重要作用，它能使组蛋白H3在赖氨酸4上发生三甲基化（H3K4me3），参与依赖和非依赖脱落酸（ABA）途径中脱水胁迫信号的传递。ATX1功能丧失导致植物萌发率下降，气孔开度增大，蒸腾加快，对脱水胁迫的耐受性降低［16］。水稻SDG708直接靶向激活ABA生物合成的关键基因NINE-CISEPOXYCAROTENIDD3（NCED3）和 NINECIS-EPOXYCAROTENIDD5（NCED5）的表达，促进ABA的生物合成。此外，SDG708还可诱导保卫细胞中过氧化氢的积累，促进气孔关闭以减少水分流失［17］。拟南芥SDG8功能丧失表现蒸腾作用加快，气孔变大，对ABA的敏感性降低，并且对脱水胁迫的耐受性降低［18］。

干旱作为影响作物生长发育和产量的重要因素之一，其对产量的影响超过其它因素的总和［19］。世界上约70%的小麦分布于干旱和半干旱地区［20］，小麦作为继玉米、水稻之后的全球第三大作物［21］，提高小麦的抗旱性对国家粮食安全具有重要的意义。本研究利用生物信息学手段，对小麦组蛋白甲基化酶基因家族中受干旱胁迫诱导的基因进行筛选，通过检测其在受干旱胁迫处理的杂交组合中的表达模式，以期为组蛋白甲基化酶在二系杂交小麦抗旱性中的功能研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 以北京市农林科学院杂交小麦研究所提供的杂交小麦组合为实验材料：父本（P）09YH91-5、 母 本（M）BS278及 其 子 一 代（F1）BS278*09YH91-5。

1.1.2 主要试剂 Trizol试剂购自Ambion公司，反转录试剂盒5×ABScript III RT Mix反转录酶（ABclonal公司）合成cDNA，使用2×Universal SYBR Green试剂（ABclonal公司）进行荧光定量PCR实验，其他生化试剂为进口或国产试剂。

1.2 方法

1.2.1 小麦TaHMT基因家族干旱胁迫响应基因筛选 为了解TaHMT基因家族干旱胁迫表达情况，将175个TaHMT基因提交到Wheat Expression Brower数据库（http://wheat-expression.com/）和WheatOmics数据库（http://wheatomics.sdau.edu.cn/）获取小麦在干旱胁迫下的表达数据，使用TBtools软件绘制基因表达热图，筛选差异表达基因［22］。为进一步筛选旱胁迫响应基因，通过文献检索获取在拟南芥和水稻中已鉴定的抗旱基因并下载蛋白序列，提交到Ensemble plant网 站（https://plants.ensembl.org/index.html）进行Blastp，检索其在小麦中同源蛋白，选取相似度较高的蛋白（E-value≤1E-100），作为同源蛋白，再将同源蛋白的基因号与175个TaHMT基因进行比较确定小麦TaHMT家族旱胁迫响应候选基因。

1.2.2 小麦TaHMT干旱胁迫响应候选基因理化性质分析 从Ensembl网站获取有关基因ID，物理位置，基因序列、蛋白质序列以及编码序列（CDS）的信息。通过在线程序Expasy（http://web.expasy.org/compute_pi/）预测TaHMT蛋白的等电点（pI）、分子量（Mw）、不稳定系数以及亲水指数等信息［23］。通过Cell-PLoc网 站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）预测每个TaHMT基因的亚细胞定位［24］。利用 Prot Scale网 站（https://web.expasy.org/protscale/）对TaHMT蛋白亲水性和疏水性进行分析［23］。

1.2.3 小麦TaHMT干旱胁迫候选基因蛋白结构预测分析 利用在线分析网站SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对8个TaHMT旱胁迫候选基因的氨基酸序列进行二级结构预测［25］。利用在线网站Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）预测TaHMT蛋白的三级结构［26］，并通过VMD软件进行可视化分析。

1.2.4 小麦干旱胁迫候选TaHMT基因系统发育与基因结构分析 为了研究TaHMT基因外显子-内含子结构，利用软件TBtools进行了映射［22］。利用在线工 具 MEME（http://meme-suite.org/index.html） 对 小麦TaHMT蛋白的保守基序进行预测（参数设置：最大基序数目=15，最佳基序宽度6-50个残基）［27］，使用TBtools导出相应的可扩展矢量图形（SVG）［22］。

1.2.5 小麦TaHMT旱胁迫候选基因同源序列比对分析 利用Ensemble plant网站搜索候选基因的直系同源序列，然后用Pfam网站（http://pfam.xfam.org/）对同源基因蛋白序列进行保守结构域验证，保留具有SET、PRMT结构域的蛋白序列。用MEGA11.0的ClustalW程序对普通小麦（Triticum aestivum L.）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、节节麦（Aegilops tauschii L.）、 二 粒 小 麦（Triticum dicoccoides L.）、 短 柄 草（Brachypodium distuchyon L.）、 水 稻（Oryza sativa L.）、 拟 南 芥（Arabidopsis thaliana L.）8个 物 种的全长氨基酸序列进行多序列比对［28］，用最大似然法（maximum likelihood）构建系统发育进化树，Jones Taylor Thornton 模型，Bootstrap值设为1 000。 用 Evolview2.0网 站（http://www.omicsclass.com/article/671）进行可视化［29］。

1.2.6 小麦TaHMT干旱胁迫候选基因顺式作用元件分析 利用TBtools软件搜索TaHMT基因转录起始位点上游2 000 bp的小麦基因组DNA序列，并用PlantCare数 据 库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对这8个基因的顺式作用元件进行分析［30］。

1.2.7 实时荧光定量PCR 在田间选取生长状况一致的营养生长期小麦，对清洗好的植株进行干旱胁迫处理，分别在干旱0 h，3 h，6 h，24 h的时间点对小麦叶片进行取样；将大小均一、成熟且饱满的小麦种子种在含有相同质量的土壤的花盆中，等小麦生长7 d左右时，对花盆进行不浇水的干旱处理，注意观察表型，对干旱处理 20 d 后的材料分别取样，每个处理设3个重复，液氮冷冻并保存在-80℃。利用Trizol提取植物材料总RNA，使用5×ABScript III RT Mix反转录酶进行反转录，得到cDNA后进行实时定量PCR。实时定量PCR使用2×Universal SYBR Green试剂在Rotor-Gene 3000定量PCR仪（gene company limited）上进行。利用Primer3.0（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计基因引物，小麦Actin基因为内参，每个样品3次重复（表1）。扩增程序：预变性95℃，3 min，变性95℃，5 s，退火 /延伸 60℃，30 s，40个循环；95℃，15 s，55℃持续升温到95℃。实时定量结果采用2-ΔΔCT比较定量法进行分析，然后使用SPSS21软件进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

2 结果

2.1 小麦TaHMT基因家族干旱胁迫响应基因的筛选

通过对小麦组蛋白甲基转移酶基因家族研究，我们筛选到175个TaHMT基因。在Wheat Expression Brower数 据 库（SRP068165） 和WheatOmics数据库（PRJNA306536）获取所有基因干旱胁迫下的表达数据（附图1）。对数据进行分析选择胁迫处理前后差异倍数大于2的基因作为干旱响应基因。在Wheat Expression Brower数据库和WheatOmics数据库中分别筛选到24、81个干旱响应基因。通过比较基因组学策略对拟南芥、水稻中已报道的抗旱相关组蛋白甲基化酶基因ATX1、SDG8、SDG708 同源比对［17-18，31］，筛选到 8个抗旱 候 选 基 因：TaHMT19、TaHMT21、TaHMT28、TaHMT31、TaHMT39、TaHMT42、TaHMT105、TaHMT113。在Wheat Expression Brower数据库和WheatOmics数据库中有17个重叠的干旱响应基因，WheatOmics数据库和同源比对基因有4个重叠的干旱响应基因（图1-A）。同源比对重叠的4个基因 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT105和从17个重叠基因中选取差异倍数较大的4个基因TaHMT24、TaHMT49、TaHMT143、TaHMT157， 总共8个基因作为组蛋白甲基化干旱胁迫响应候选基因（图1-B、图1-C），其中 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42为同源基因。

图1 小麦TaHMT候选基因干旱胁迫表达热图Fig.1 Heatmap of TaHMT candidate gene expressions under drought stress in wheat

2.2 小麦TaHMT干旱胁迫响应候选基因理化性质分析

小麦干旱胁迫响应候选TaHMT基因分子量在42 293.23-122 007.19 kD之间，编码蛋白由309-1 086个氨基酸组成，蛋白质的理论等电点各不相同，大部分等电点在7以下，偏酸性，但TaHMT49和TaHMT105的等电点呈弱碱性，分别为7.09和7.59。不稳定蛋白指数介于38.91-54.59之间，大部分蛋白不稳定指数大于40是不稳定蛋白，但TaHMT157不稳定指数为38.91，稳定性较好。用Cell-PLoc预测蛋白在细胞中的位置，发现8个基因都定位于细胞核（表2）。利用Prot Scale网站分析候选基因氨基酸序列的亲水性和疏水性，发现部分蛋白的亲水性和疏水性不同，其中TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42的亲疏水性相同（图2）。总体而言，TaHMT蛋白的亲水氨基酸比疏水氨基酸多，表现为亲水蛋白。

表2 TaHMT干旱胁迫候选基因基本信息Table 2 Basic informationof TaHMTdrought stress candidate genes

2.3 小麦干旱胁迫候选TaHMT基因蛋白结构预测

为进一步了解TaHMT干旱胁迫候选基因的蛋白结构，对候选基因的氨基酸序列进行二、三级结构预测。通过二级结构分析发现，TaHMT蛋白均由α螺旋、β转角、延伸链和无规则卷曲等结构元件组成，α螺旋和无规则卷曲所占的比例最高，延伸链次之，β转角最 少（表3）。 其中 TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143、TaHMT157蛋白无规则卷曲所占的比例最高达到50%左右，而TaHMT24蛋白中α螺旋所占比例最高，这可能导致TaHMT24与其它蛋白具有不同的功能。通过对蛋白三级结构的预测（TaHMT105蛋白未知），发现TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42的三级结构非常相似，但与其他基因的蛋白结构存在差异（附图2）。

表3 小麦TaHMT蛋白的二级结构分析Table 3 Secondary structure analysis of TaHMT proteins

图2 TaHMT蛋白亲疏水性分析Fig.2 Analyzed hydrophilicity and hydrophobicity for TaHMT protein

2.4 小麦TaHMT干旱胁迫候选基因同源蛋白序列比对

通过对普通小麦（T.aestivum L.）、乌拉尔图小麦（T.urartu L.）、大麦（H.vulgare L.）、节节麦（A.tauschii L.）、 二 粒 小 麦（T.dicoccoides L.）、 短柄草（B.distuchyon L.）、水稻（O.sativa L.）、拟南芥（A.thaliana L.）8个物种的进化分析（图3），发现TaHMT42和TaHMT49蛋白序列与节节麦（AET-2Gv20684800.3和AET2GV21311500.2）的亲缘关系最近；TaHMT24蛋白序列与水稻（Os07t0640000-01）的亲缘关系较近；TaHMT31蛋白序列与二粒小麦（TRIDC2BG046490.4）的亲缘关系最近；TaHMT105蛋白序列与短柄草（KQJ86923）的亲缘关系较近；TaHMT21和TaHMT143分别与大麦（HORVU2Hr1G074910.1和HORVU7Hr1G086320.1） 的亲缘关系最近；TaHMT157蛋白序列与乌拉尔图小麦（TRIUR3 10876-T1）的亲缘关系最近。其中TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42聚集在同一分支上，TaHMT24和TaHMT157聚集在同一分支上，它们的关系更近，可能具有相同的功能。

图3 TaHMT蛋白的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TaHMT

2.5 小麦干旱胁迫候选TaHMT基因系统发育与基因结构分析

通过基因结构分析发现8个TaHMT基因结构存在较大的差异，其中TaHMT105外显子数量最多（24个），TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42外显子相似，TaHMT143仅有2个外显子。利用MEME网站对TaHMT基因的氨基酸序列进行保守基序分析，发现TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42蛋白motif组成及其分布与其他基因差异较大，含有多种motif结构；TaHMT24、TaHMT143、TaHMT157蛋白仅含有1个motif结 构：motif10 或 motif15（ 图4）。TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42和TaHMT49蛋白都有motif4；TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42和 TaHMT105都有motif1；TaHMT24、TaHMT105和TaHMT157都有motif15。

图4 小麦TaHMT干旱胁迫候选基因基因结构和保守基序分析Fig.4 Gene structure and conserved motifs analysis of wheat TaHMT drought stress candidate genes

2.6 小麦TaHMT干旱胁迫候选基因启动子顺式作用元件分析

顺式作用元件在植物的非生物胁迫应激反应中起着重要的调控作用［32］。通过对TaHMT干旱胁迫候选基因启动子顺式作用元件分析发现，8个候选基因都含有干旱响应相关顺式作用元件如：ABRE［33］、MBS［34-35］、CGTCA-motif 和 TGACG-motif［36-38］（ 附表1）。TaHMT42只 有 TGACG-motif，CGTCA-motif两种响应元件；TaHMT21，TaHMT24，TaHMT49有3种响应元件，其作用元件的种类和数目有所不同；TaHMT31，TaHMT105，TaHMT143和TaHMT157有4种旱响应元件，但每种响应元件的数目不同；其中TGACG-motif，CGTCA-motif两种响应元件是8个基因所共同拥有的（图5）。我们推测启动子作用元件的不同，从而受上游调控的转录因子不同，可能是导致干旱胁迫下TaHMT基因表达量差异的重要原因。

图5 TaHMT干旱胁迫候选基因干旱响应元件种类和数目Fig.5 Types and number of drought response elements of TaHMT drought stress candidate genes

2.7 小麦TaHMT干旱胁迫下实时定量PCR分析

为进一步验证TaHMT基因的干旱表达模式，使用杂交组合 BS278（M）、BS278*09YH91-5（F1）、09YH91-5（P）对TaHMT基因表达进行荧光定量PCR分析，其中BS278母本不抗旱，09YH91-5父本抗旱，BS278*09YH91-5和父本09YH91-5表型相似表现为抗旱，即在定量表达时干旱处理后BS278*09YH91-5和09YH91-5的表达应相似，但与BS278的表达存在显著性差异。结果显示，TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143和 TaHMT157均受到干旱胁迫的诱导，随胁迫时间的增加表达量先上调后下调（图6-A）。其中在某一时间段，母本BS278的表达量高于父本09YH91-5和杂交种BS278*09YH91-5的表达，这可能与组蛋白甲基化酶干旱胁迫诱导表达特性相关，即基因表达量越高越不抗旱。在营养生长期TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT143 和TaHMT157定量表达结果符合杂交种及父母本的干旱表型（图6-A）；在苗期地上部分的定量表达中 TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42、TaHMT49和TaHMT143符合杂交种及父母本的干旱表型（图6-B）；在苗期地下部分的定量表达中TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42和TaHMT105符 合 杂 交 种及父母本的干旱表型（图6-C），其中TaHMT21、TaHMT24和TaHMT42在小麦不同时期不同组织的材料中都符合杂交种及父母本的表型。因此，推测TaHMT21、TaHMT24和TaHMT42可能参与调控杂交种的抗旱性。

图6 TaHMT干旱胁迫下的表达模式分析Fig.6 Expressions of TaHMT under drought stress

3 讨论

组蛋白甲基化作为一种表观遗传调控机制，在动植物的生长发育包括细胞周期调节、异染色质形成、应激反应、转录激活与沉默等方面发挥着重要作用［13，39］。本研究对已鉴定的175个组蛋白甲基化酶基因家族成员通过干旱数据库和同源序列比对共筛选到8个旱胁迫响应候选基因。理化性质分析发 现 TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT143、TaHMT157都偏酸性、分子量大小相近、都位于细胞核中，推测这几个基因的功能相似。蛋白结构预测发现TaHMT蛋白结构组成元件相同，但每种元件的比例与分布存在差异，其中TaHMT24蛋白α螺旋比例最高，可能形成某种特殊的结构使其具有独特的功能。基因结构分析发现TaHMT基因所含内含子外显子数目不同，但其富集区域相似；motif分析发现TaHMT蛋白具有不同的motif，但也具有相同的motif基序如motif1和motif15，推测这两种motif基序可能在组蛋白甲基化酶干旱胁迫响应中发挥重要作用。顺式作用元件分析发现8个TaHMT旱胁迫候选基因都含有旱胁迫响应元件，但元件的种类和数目不同，说明TaHMT基因可能受到旱胁迫响应，但每个基因受响应的程度不同，存在表达差异。

多物种同源序列比对分析显示：TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42 和 Os04t0429100（SDG708）聚集在同一分支，而研究发现水稻SDG708与ABA生物合成关键基因结合，增加内源ABA含量，从而调控水稻的耐旱性［17］，由此推测TaHMT21、TaHMT31和TaHMT42参与小麦旱胁迫响应。AT2G31650（ATX1）通过催化H3K4me3，激活ABA生物合成基因NCED3，提高拟南芥的抗旱性［16-31］。另外ATX1参与根的发育、干细胞生态维持和细胞模 式 的 形 成 过 程［40］；Os09t0134500（Ostrx1） 与开花时间调控相关［41］。因此，推测作为与ATX1、Ostrx1聚集在同一分支的TaHMT105具有提高小麦抗旱性的功能。AT5G12270（AtPRMT3）是前体RNA加工和核糖体生物合成所必需的，能够促进植物的生长发育［42］，AT5G43990（SUVR2）参与基因沉默［43-44］，作为分别和AtPRMT3、SUVR2处于同一分支的TaHMT157、TaHMT49可能具有相似的功能。

此外，本研究对TaHMT旱胁迫候选基因的表达模式进行分析。TaHMT21、TaHMT24、TaHMT31、TaHMT42、TaHMT49、TaHMT105、TaHMT143 和TaHMT157基因均受到干旱胁迫的诱导，随着处理时间的增加表达量呈先上调后下调的模式，但除了在WheatOmics数据库中TaHMT49表现为先下调后上调，TaHMT143表现为先上调后下调外，大部分基因在Wheat Expression Brower数据库和WheatOmics数据库中都呈现下调表达模式，这可能是由于在不同材料中不同基因受干旱胁迫诱导表达程度不同，取样时间不同造成的差异。在过表达的SDG708能够增加水稻的抗旱性［17］，但与SDG708同源的TaHMT21、TaHMT31、TaHMT42基因在小麦杂交组合中的表达表现为表达量较高的母本不抗旱，表达量较低的父本抗旱，推测该基因可能具有物种特异性。这些抗旱相关基因符合杂交种（F1）BS278*09YH91-5及父母本的表型，推测这些基因可能参与杂交种的抗旱调控。下一步将对这些TaHMT候选基因对小麦杂交种逆境胁迫的应答调控进行功能验证。

4 结论

通过对组蛋白甲基化酶基因家族干旱胁迫响应候选基因的生物信息学分析和实时定量PCR验证，发现TaHMT21、TaHMT24、TaHMT42基因可能参与调控小麦杂交种的抗旱，为二系杂交小麦抗逆分子育种提供了重要的抗旱功能标记。

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