文/许 培 史文青 葛传军 刘 虎 卞从明[安徽安科生物工程（集团）股份有限公司]

多肽是指由3～50 个α- 氨基酸缩合后以酰胺键连接的一类化合物。分子量介于化药与蛋白药物之间，兼顾了化药纯度高、稳定性好及低免疫原性的特点，也具有蛋白药物特异性强、生物活性高等特点，在肿瘤、糖尿病、心血管疾病、感染等领域有显著疗效[1]。

多肽的制备方式包括生物组织提取、基因重组表达和化学合成法，其中化学合成法有液相合成和固相合成两种。目前，全球上市的多肽药物中90%以上是由化学合成制备，且固相合成法应用最为普遍。固相合成法是采用α- 氨基被保护的Boc- 氨基酸或Fmoc- 氨基酸作为起始物料，将其C 端固定在树脂上，通过一系列“缩合”和“脱保护”操作，直至合成目标序列后再将树脂与肽链裂解，获得目标肽粗品。由于Fomc- 氨基酸可在碱性条件下进行脱保护，避免中间体反复经强酸处理，可有效降低反应副产物，是目前固相合成法中的最为常用的起始物料[2]。

QbD（质量源于设计）重要理念之一是强调对关键原料的关键质量属性进行评估和控制。目前各国药监部门或国际组织均对API 起始物料质量控制提出要求[3]，如ICHQ11[4]中强调了起始物料的监控及其杂质谱研究的必要性，要求研究者充分了解并评估其在生产过程中的行为，建立其与API 杂质的关系；EMA 于2014 年发布的《化学原料药生产起始物料的选择和论证要求的思考》[5]明确了起始物料的评估意见和要求，于2016 年发布的《活性物质化学部分指南》[6]强调“应讨论起始物料中的所有种类杂质，如异构体杂质，在后续合成过程中保持不变或作为衍生物留存的可能性。适当时，此类杂质应当在起始物料中通过验证的检验方法控制在合适的限度”；FDA 也发布了多项指导原则[7-8]，明确了起始物料的选择及控制要求。

芴甲氧羰基氨基酸（Fmoc-aminos）是固相合成多肽的关键起始物料，其杂质与最终API 杂质具有显著的相关性，其中以对映异构体杂质影响最为显著。该杂质参与缩合反应，会产生与目标物结构、性质极为接近的差向肽杂质[9]。差向肽杂质与API 通常难以分离，给后续提纯工艺及产品质量控制带来挑战，临床应用时也可能存在安全及有效性的风险。因此，需建立严格的质控要求。

本文以固相合成多肽中较为常用的Fmoc-L-Leu-OH 为研究对象，建立了HPLC 检测Fmoc-L-Leu-OH 对映异构体Fmoc-D-Leu-OH 含量的方法，并开展了系统的方法学验证。

一、材料

1.主要材料和试剂

芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH），芴甲氧羰基-D- 亮氨酸（Fmoc-D-Leu-OH），注射用水，正己烷，无水乙醇，异丙醇，三氟乙酸。

2.主要仪器设备

赛默飞U3000 高效液相色谱系统，紫外检测器，电子天平。

二、方法与结果

1.试液配制

空白溶液：正己烷∶无水乙醇（55∶45）。

系统适用性溶液：取Fmoc-L-Leu-OH 对照品与Fmoc-D-Leu-OH 对照品适量，用空白溶液配制成Fmoc- L- Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH 浓度分别为2.0 mg/mL、10.0 μg/mL 的混合溶液。

Fmoc-Leu-OH 供试品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH供试品，用空白溶液制成浓度为2.0 mg/mL 的溶液。

Fmoc-L-Leu-OH 对照品溶液：取Fmoc-L-Leu-OH对照品，用空白溶液制成浓度为2.0 mg/mL的溶液。

Fmoc-D-Leu-OH 对照品溶液：取Fmoc-D-Leu-OH 对照品，用空白溶液制成浓度为2.0 mg/mL 的溶液。

2.色谱条件

3.专属性考察

分别取空白溶液、系统适用性溶液按前述色谱条件进样，考察方法专属性。空白溶液在Fmoc-D-Leu-OH 色谱峰保留时间9.900 min 左右无吸收峰；系统适用性溶液中Fmoc-L-Leu-OH 色谱峰保留时间为9.900 min，其对映异构体Fmoc-D-Leu-OH 色谱峰保留时间为14.297 min，二者之间分离度为6.38，分离度远大于2.0，表明方法专属性良好。

4.检测限及定量限

取Fmoc-D-Leu-OH 对照品溶液，用空白溶液逐级稀释至适宜浓度，按前述色谱条件分别进样测定，分别以信噪比为3∶1、10∶1 时注入仪器的量作为检测限和定量限。Fmoc-D-Leu-OH 的检测限、定量限分别为0.300 ng 和1.001 ng，即分别相当于主成分的0.0015%、0.0050%，表明方法色谱灵敏度高。

5.线性范围考察

取Fmoc-D-Leu-OH 对照品溶液，用空白溶液稀释成系列浓度分别为0.1 μg/mL（定量限）、0.2μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0μg/mL 的溶液，按前述色谱条件分别进样测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归，确定线性范围。回归方程为Y=0.5126X-0.0049，R2=1.0000，表明Fmoc-D-Leu-OH 在质量浓度0.1 ～10.0 μg/mL 范围内，线性关系良好。

6.准确度（加样回收）

取Fmoc-L-Leu-OH 供试品、Fmoc-D-Leu-OH 对照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 浓度为2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 质量浓度分别约为16μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 溶液各3 份（对映异构体含量相当于质控限度的80%、100%、120%）；另取Fmoc-LLeu-OH 供试品溶液，按照前述色谱条件分别进样测定，考察高、中、低3 个水平的加样回收率。3 个不同水平的Fmoc-D-Leu-OH 的平均回收率（n=3）分别为100.85%、100.76%和100.89%；3 个水平总平均回收率（n=9）为100.83%，相对标准偏差（n=9）为0.90%，表明方法准确度高。

7.精密度（重复性）

取Fmoc-L-Leu-OH 供试品、Fmoc-D-Leu-OH 对照品，用空白溶液配制成Fmoc-L-Leu-OH 浓度为2.0 mg/mL、Fmoc-D-Leu-OH 浓度为20 μg/mL 溶液，按照前述色谱条件连续进样6 次，计算Fmoc-D-Leu-OH色谱峰保留时间和面积的相对标准偏差（n=6），结果分别为0.18%（n=6）和1.86%，说明精密度良好。

8.供试品溶液稳定性

取Fmoc-L-Leu-OH 供试品适量，精密称定，用空白溶液溶解并稀释制成每1 mL 中约含2.0 mg 的供试品溶液，于室温下分别放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，按照前述色谱条件分别进样，考察其稳定性。结果显示，供试品中对映异构体Fmoc-D-Leu-OH 含量未发生变化，空白溶剂对测定无干扰，表明供试品溶液于室温存放12 h 内稳定。

9.耐用性实验

改变流速。将色谱条件中的流速分别设定为0.9 mL/min、1.0 mL/min 和1.1 mL/min，其余色谱条件不变，分别进样，考察不同流速对测定供试品中对映异构体含量的影响。结果显示，同一供试品在3 种不同流速下Fmoc-D-Leu-OH 检出结果一致。

改变柱温。将色谱条件中的温度分别设定为28℃、30 ℃和32 ℃，其余色谱条件不变，分别进样，考察不同温度对测定供试品中对映异构体含量的影响。结果显示，同一供试品在3 种不同温度下Fmoc-D-Leu-OH 检出结果一致。

10. 供试品Fmoc-L-Leu-OH 中Fmoc-D-Leu-OH 含量测定结果

按照建立的方法对3 批Fmoc-L-Leu-OH 进行测定，均未检出Fmoc-D-Leu-OH，表明供试品中对映异构体杂质含量均低于检测限（0.0015%），远低于质控限度（0.1%）。

三、结论

本文按自建的HPLC 方法，通过全面的方法学验证，建立了Fmoc-L-Leu-OH 中对映异构体含量测定方法。验证结果表明：空白溶液对测定无干扰，各组分可完全分离；对映异构体检测限及定量限分别为主成分的0.0015%、0.0050%，本方法灵敏度良好；对映异构体杂质含量在0.1～10.00 μg/mL（相当于杂质含量为0.005%～0.5%）范围内线性关系良好（R2=1.0000）；低、中、高3 个对映异构体不同浓度的加样回收率分别为100.85%、100.76%及100.89%；该色谱条件下样品存放、柱温、流速耐受性良好。该方法可用于Fmoc-LLeu-OH 中对映异构体含量的测定和控制。