马灵珍，纪东汉，鞠 康，薛天乐，文 永

1亳州职业技术学院药学院；2安徽省中医药科学院亳州中医药研究所；3安徽爱生中药饮片有限公司，亳州 236800

中药材为中国传统中医特有药物，在预防与治疗疾病方面发挥了重要的作用。中药材种类繁多、来源广泛，具有作用的整体性、组成成分的多样性、作用靶点的复杂性以及成分间相互作用的特点，中药的产品质量直接影响中医临床疗效，所以有效控制中药的质量，是保证中医临床疗效的前提。但由于中药化学成分含量普遍较低，且部分化学成分不稳定，使得中药化学对照品不易制备且价格昂贵，造成多指标的质控模式难以推广。中药材质量评价模式多基于传统经验、多指标成分、指纹图谱及谱效关系等评价模式来对其质量进行综合评价。但上述评价方法多存在主观因素影响、实验繁琐复杂及重现性不好等缺点，目前多指标综合评价模式仍是中药质量评价的主要研究方向。一测多评(quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS)的多指标质量控制方法是利用一种易得廉价的内参比物质对照品，实现对多种成分的同时测定，最终达到控制中药整体质量的目的。化学计量学(chemometrics)作为一种近代新兴的分析实验方法，其重要特征为将多变量方法引入到化学研究中，计算出研究对象的信息，以及在对大量样本进行处理时可快速、全面地鉴别归类。优劣解距离法(TOPSIS)是一种多指标的决策分析方法，目前已被广泛用于多种中药材的质量评价中。该方法可客观地对各指标进行权重赋值，有效避免人为主观因素对中药材内在质量评价的影响。

车前子为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟种子，具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰之功效[1]。车前子应用广泛，且药源丰富，具有广阔的开发利用前景。盐车前子为其炮制品，是我国传统的常用中药，应用历史悠久，疗效确切。车前子含有多种化学成分，主要包括环烯醚萜类、苯乙醇苷类、黄酮类、生物碱类、三萜类以及甾醇类等化合物[2,3]。但车前子属于多基原药材，其种质资源遗传多样性的地理差异较为明显，野生种与栽培种基因型差异较大，各成分含量差异相应较大，成分不同，疗效不同，因此，建立一个科学、便捷、合理的质量评价方法，对盐车前子的质量进行全面准确地评价并指导车前子资源的合理利用具有重要的现实意义。Li等[4]采用AHP-CRITIC混合加权法和响应面法对盐车前子炮制工艺进行了优化，Gu等[5]采用UPLC-Q-TOF/MS法对车前子生品和盐炙品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷进行了定量控制研究，Li等[6]采用药理学联合代谢组学方法，对比考察了生车前子和盐车前子对盐水负荷模型大鼠的利尿作用并明其作用机制，目前研究中对盐车前子定量控制成分较少，也未检索到对其所含成分进行一测多评法研究，以及采用化学计量学联合熵权优劣解距离法综合质量评价的文献报道，本研究收集江西、河南、安徽、山东和广西等5个省共18个代表性产地的车前子药材，按2020年版中国药典一部车前子项下盐车前子炮制要求以及四部盐水炙法对车前子进行同方法炮制，采用HPLC-QAMS法测定盐车前子中10种成分，通过化学计量学结合熵权TOPSIS法对不同产地来源车前子盐制品进行综合质量评价。以期为盐车前子的整体质量控制提供科学实验数据，为车前子资源合理开发与利用提供参考。

1 材料

1.1 试药

对照品桃叶珊瑚苷(批号111761-202102，含量98.4%)、京尼平苷酸(批号111828-201805，含量98.1%)、大车前苷(批号11914-202105，含量96.0%)、毛蕊花糖苷(批号111530-201914，含量95.2%)、槲皮素(批号100081-201610，含量99.8%)、山柰酚(批号110861-202013，含量93.2%)、木犀草素(批号111520-202107，含量96.3%)和芹菜素(批号111901-202004，含量99.4%)源于中国食品药品检定研究院；对照品10-羟基大车前草苷(批号327-97-9，含量97.0%)源于上海纯优生物科技有限公司；异毛蕊花糖苷(批号PRF9010243，含量97.0%)源于成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈和磷酸为色谱纯级别，其余试剂为分析纯；车前子药材来源于车前PlantagoasiaticaL.的干燥种子，信息见表1。

表1 车前子药材信息

1.2 仪器

高效液相色谱仪(Shimadzu LC-20A型，日本岛津公司)；高效液相色谱仪(Waters e2695型，Waters公司)；色谱柱Discovery C18、Waters XBridge C18和Durashell C18，规格均为5 μm，250 mm×4.6 mm；电子分析天平(XSE205DU型，Mettler Toledo)。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素对照品适量，用70%甲醇制成质量浓度分别为0.374、3.950、0.092、0.974、2.710、0.632、0.216、0.438、0.076和3.190 mg/mL的混合对照品贮备液，再将贮备液用70%甲醇稀释20倍得混合对照品溶液(上述10种对照品质量浓度分别为0.018 7、0.197 5、0.004 6、0.048 7、0.135 5、0.031 6、0.010 8、0.021 9、0.003 8和0.159 5 mg/mL)。

2.2 供试品溶液的制备

取净车前子按中国药典2020年版一部车前子项下方法进行炮制，得盐车前子；取盐车前子粉末约0.6 g，精密称定，精密加70%甲醇25 mL，称重，加热回流60 min，放冷，70%甲醇补重，摇匀，过滤，即得。

2.3 色谱条件及专属性试验

Discovery C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱，柱温30 ℃；检测波长分别为210 nm(0～22 min检测桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和10-羟基大车前草苷)[7-9]、330 nm(22～35 min检测大车前苷、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷)[10-15]和360 nm(35～65 min检测槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素)[16,17]；流动相选用0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，流速维持1.0 mL/min进行梯度洗脱(0～12 min，21.0%B；12～22 min，21.0%→35.0%B；22～35 min，35.0%→47.0%B；35～54 min，47.0%→75.0%B；54～65 min，75.0%→21.0%B)，进样量10 μL。在上述色谱条件下进样混合对照品溶液及供试品溶液，记录色谱图(见图1)。图谱显示盐车前子供试品溶液中10种成分与相邻色谱峰分离良好(分离度均≥1.5)。

图1 混合对照品(A)和供试品(B)的HPLC色谱图

2.4 多指标成分定量检测

2.4.1 线性关系考察

取“2.1”项下混合对照品贮备液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别用70%甲醇稀释200、100、40、20、10和4倍，摇匀制得系列线性工作溶液，按“2.3”项色谱条件进样检测，记录色谱图，以桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素对照品质量浓度为横坐标(X，μg/mL)，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，结果见表2。

表2 盐车前子中各成分的线性关系

2.4.2 精密度、稳定性及重复性试验

取盐车前子(编号：S1)一份供试品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，记录桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色谱峰峰面积，得峰面积的RSD值依次为1.03%、0.56%、1.18%、0.95%、0.71%、1.02%、1.15%、1.07%、1.34%和0.60%，表明精密度良好。取一份盐车前子(编号：S1)供试品溶液，于制备后0、2、4、6、10、16和24 h进样，记录桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色谱峰峰面积，得峰面积的RSD值依次为1.04%、0.53%、1.16%、1.01%、0.74%、0.99%、1.17%、1.05%、1.31%和0.62%，表明盐车前子供试品溶液24 h内稳定。取盐车前子(编号：S1)适量，按“2.2”项下方法制备盐车前子供试品溶液6份，在上述色谱条件下检测分析，记录色谱峰峰面积，用外标法计算桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素的含量，得含量的RSD值依次为1.27%、0.93%、1.74%、1.58%、1.09%、1.21%、1.69%、1.42%、1.89%和1.08%，表明重复性良好。

2.4.3 加样回收率试验

取盐车前子(编号：S1)细粉9份，每份精密称定0.3 g，分别加入混合对照品溶液(桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素对照品质量浓度分别为0.259、2.748、0.067、0.651、1.865、0.428、0.171、0.332、0.057和2.109 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL(各平行3份)，再按“2.2”项方法制得加样供试品溶液，在上述色谱条件下检测，得10种成分的平均加样回收率为98.61%、100.10%、96.89%、99.23%、100.04%、98.89%、97.69%、97.88%、96.96%和99.87%；RSD分别为1.31%、0.59%、1.27%、0.98%、0.74%、1.39%、1.46%、1.11%、1.53%和0.69%。

2.5 HPLC-QAMS质量评价模式的建立

2.5.1 相对校正因子(f)的计算

以毛蕊花糖苷为内参比物质，进样“2.4.1”项6个混合对照品溶液，按照公式fi/s=fi/fs=(ρi/Ai)/(ρs/As)=(ρi×As)/(ρs×Ai)计算f。式中f、ρ、A、i、s依次代表相对校正因子、质量浓度、峰面积、内参比物质和其他待测成分，结果见表3。

表3 盐车前子中各成分的f

2.5.2 相对校正因子(f)耐用性考察

分别考察了仪器及色谱柱、流速和柱温的改变对f的影响，选用液相色谱仪(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色谱柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)，流速：1.0±0.2 mL/min，柱温：30±5 ℃等条件，取混合对照品溶液依法进样检测，结果仪器与色谱柱对所建立的f无影响(见表4)、流速对所建立的f无影响(见表5)、柱温对所建立的f无影响(见表6)。

表4 不同仪器及色谱柱对f的影响

表5 不同流速对f的影响

表6 不同柱温对f的影响

2.5.3 色谱峰定位

在上述色谱条件下，取“2.1”项下混合对照品溶液，依法进样检测，记录色谱峰保留时间，采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，考察液相色谱仪(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色谱柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)对相对保留时间值(t)的影响，结果采用相对保留时间值法可以对目标化合物色谱峰进行准确定位(见表7)。

表7 仪器及色谱柱对t的影响

2.6 含量测定

取18批盐车前子(S1～S18)，依法制备盐车前子供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，分别运用ESM和HPLC-QAMS法计算盐车前子中10种成分的含量(见表8)。结果两种方法无显著性差异(P>0.05)，表明HPLC-QAMS法可用于盐车前子中10种成分的含量测定。

表8 盐车前子中10种成分含量测定结果(n=3)

2.7 聚类分析(CA)

聚类分析(cluster analysis，CA)指将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程，是通过数据建模简化数据的一种方法。将表8中18批盐车前子的10种成分QAMS法测定结果导入SPSS 26.0统计软件，采用平均联接(组间)法，利用Euclidean距离为样品的测度进行聚类分析，得聚类树状图(见图2)。结果显示，当间距为15时，18批盐车前子样品聚为3类，S16、S18、S17、S14、S15和S13共6批样品聚为一类，S11、S12、S9、S10共4批样品聚为一类，S7、S8、S1、S2、S3、S4、S5和S6共8批样品聚为一类。

图2 18批样品聚类树状图

2.8 主成分分析(PCA)

主成分分析(principal component analysis，PCA)是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。是从原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关。将表8中QAMS法测定结果导入SPSS 26.0统计软件采用降维的方式对主成分进行提取，得各主成分特征值和方差贡献率(见表9)及成分矩阵表(见表10)。由表9可知前2个主成分特征值大于1，即6.778和1.737，对方差的贡献率分别为67.780%和17.369%，累计方差贡献率为85.149%，大于85%，表明选取前2个主成分即可代表盐车前子85.149%的信息量。表10主成分矩阵可以看出第一主成分的信息来自京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素等成分的综合，第二主成分的信息来自桃叶珊瑚苷、大车前苷和异毛蕊花糖苷的信息。同时应用统计软件SIMCA 14.1建立PCA模型，18批盐车前子样品PCA得分图见图3，共提取出2个主成分R2X为0.851，大于0.5，所建立的模型稳定性较高。从图3可以看出，S1～S8、S9～S12以及S13～S18分别呈现一定关联性。

图3 PCA得分图

表9 盐车前子中主成分方差分析

表10 盐车前子中10种成分的成分矩阵表

2.9 正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘法-判别分析通过对数据的分析，能够查找出引起产品质量差异的特征成分，将表8中QAMS法含量数据导入SIMCA 14.1统计软件，运行OPLS-DA程序得图4，结果累积解释能力参数(R2X、R2Y)分别为0.972和0.886，预测能力参数Q2为0.741，两者高于0.5(50%)时所建立的模型稳定可靠、预测能力强。由图4可以看出18批盐车前子的含量数据点均落在95%置信区间内，根据分布可分为3类，与聚类分析和主成分分析结果一致。

图4 18批盐车前子样品的OPLS-DA模型得分图

对所建立的OPLS-DA模型中2个主成分进行200次置换检验(见图5)，结果显示R2拟合直线Y轴截距为0.275，小于0.3，表明所建立的OPLS-DA模型结果可靠；Q2拟合直线Y轴截距为-0.694(为负数)，表明所构建的OPLS-DA模型不存在过度拟合，预测能力好，可有效判别分析18批盐车前子的质量差异。根据变量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值筛选影响盐车前子化学成分差异的标志性成分(见图6)，结果VIP>1的有4个成分，即成分5(毛蕊花糖苷，VIP=1.502)、成分2(京尼平苷酸，VIP=1.441)、成分10(芹菜素，VIP=1.329)、成分4(大车前苷，VIP=1.229)对盐车前子样品质量的影响较大，是影响盐车前子产品质量的主要潜在标志物。

图5 OPLS-DA置换检测结果图

图6 18批盐车前子样品的VIP图

2.10 熵权TOPSIS(EW-TOPSIS)法分析

2.10.1 归一化处理

表11 各指标归一化处理结果

2.10.2 加权决策矩阵的构建

表12 加权矩阵

2.10.3 最优与最劣方案的确定

根据加权决策矩阵得到最优方案 Z+=max(Z1，Z2…...Zm)和最劣方案 Z-=min(Z1，Z2…...Zm)得Z+=max(0.779 0，1.441 0，0.337 0，1.229 0，1.502 0，0.863 0，0.440 0，0.750 0，0.412 0，1.329 0)，Z-=min(0，0，0，0，0，0，0，0，0，0)。

2.10.4 贴近度的计算及评价

表13 盐车前子药材质量评价排序

排名前6位分别是江西新干、江西吉水、江西樟树、江西瑞昌、江西宜春和江西泰和车前子所得盐制品，结果表明江西产地所得盐车前子整体质量较好，其次为河南、安徽、山东和广西产地所得盐车前子。

3 讨论与结论

3.1 供试品溶液制备

本试验在制备供试品溶液时，首先筛选了提取溶剂：60%甲醇[2-4,7]、70%甲醇[9,14]、70%乙醇[17]，结果发现70%甲醇提取时，所测10种成分的提取率较高。接着对提取方式及时间进行了考察，采用超声和加热回流，时间分别为40、50、60、70 min，结果发现70%甲醇加热回流提取60 min时，10种成分的提取率最高，杂质干扰最少。综合考虑，最终确定以70%甲醇回流提取60 min为盐车前子供试品最佳提取方式。

3.2 QAMS法与化学计量学结果评价

为客观评价车前子药材质量，选取全国5个省不同产地的车前子18批，统一按照现行中国药典中盐车前子的方法进行炮制，采用QAMS法和ESM法对18批盐车前子中的10种成分进行定量分析检测，同时结合化学计量学对检测结果进行分析，结果18批不同产地盐车前子中桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羟基大车前草苷、大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素10 种化学成分含量存在一定的波动，但同一产地的车前子质量相对稳定。EW-TOPSIS结果显示，江西产地所得盐车前子整体质量较好，江西省新干县所得盐车前子最优解欧氏贴近度均值高于其余几个产地样品，提示江西省新干县产车前子所得盐制品整体质量较佳。

综上，本试验采用HPLC-QAMS法结合化学计量学及熵权TOPSIS法对不同产地所得盐车前子进行了综合质量评价，建立了盐车前子10种指标成分定量质控模式，较已有文献报道，增加了定量测定成分数量，同时HPLC-QAMS法有效降低了检验成本，有利于多指标成分定量控制模式的普及应用，并建立了化学计量学联合熵权优劣解距离法综合质量评价方法，所建立的方法稳定、准确、可行，从多方面、多角度控制该药材质量，为其质量标准建立提供实验基础，也为进一步探讨不同产地所得盐车前子化学成分引起的药效差异及药材资源的合理利用提供了数据支撑。同时中药材基原对其产品质量也会产生一定的影响，本研究选取同一基原车前子所得盐车前子进行多指标成分定量控制以及化学计量学综合评价，后续将收集不同基原产品开展进一步研究。