UPLC-MSMS法同时测定配合饲料中9种药物

2022-09-08赵健付岩王全胜

浙江农业科学 2022年9期

赵健，付岩，王全胜

(宁波市农业科学研究院宁波市农产品质量检测中心，浙江宁波 315040)

配合饲料是由粮谷和不同营养组分等按特定配比配制而成，是畜禽的食物。饲料的质量决定了畜产品的质量，畜产品的质量问题可以从饲料质量检验中找出。粮谷生长过程中，农药被用来防治病虫草害[1]；真菌毒素、呕吐毒素等产生于粮谷种植和贮藏过程[2]；抗生素被一些饲料生产企业和养殖企业在饲料中违规使用[3]。因此，配合饲料存在3类有毒有害物质超标的风险，对畜禽产品造成污染，最终通过食物链转移到人体内，所以对饲料中3类有毒有害物质的监测非常必要。3类药物，目前检测仪器主要有液相色谱[4-6]、气相色谱[7-8]、UPLC-MSMS[9-11]、气质联用(GC-MS)[12-15]等，但仍以单类农药残留、兽药残留和真菌毒素为主，同时检测配合饲料中3种有毒有害物质的方法仍少见。本文拟开发配合饲料中农药残留、兽药残留和真菌毒素等3大类，共9种(黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、金刚烷胺、三唑磷、多菌灵、甲草胺)同时检测方法。旨在为配合饲料样品快速检测3类有毒有害物质提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲酸、甲醇、乙腈，色谱纯；超纯水；多壁碳纳米管、N-丙基乙二胺、C18购于上海安谱；黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮购于加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)，磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星、金刚烷胺购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，三唑磷、多菌灵、甲草胺购于天津环保，固标均大于95%，液标含量为1 000 mg·L-1；仔猪配合饲料。

Milli-QADVA10超纯水仪；Waters UPLC/XEVO TQ MS；SIGMA 离心机；Mettler-Toledo 电子天平(XPE205、PL3002)；IKA控温摇床；Organomation 氮吹仪；IKA T25 digital匀浆机。

1.2 溶液配制

1.2.1 储备和工作标液配制

乙腈溶解适量AFB1、DON、玉米赤霉烯酮、磺胺间甲氧嘧啶、恩诺沙星等固标，得到100 mg·L-1储备液；三唑磷、多菌灵、甲草胺转移并稀释至乙腈相中，得到100 mg·L-1储备液；乙腈配制5 mg·L-1工作液。

1.2.2 基质标液配制

按1.3节前处理，得到的空白样液，将5 mg·L-1工作液稀释至系列基质标液，随配随用。

1.2.3 提取溶液配制

按照体积比，将乙腈、水、甲酸混合配制成提取液：90∶9∶1、80∶19∶1、70∶29∶1等3种。

1.2.4 定溶液

按9∶1体积比，将0.1%甲酸水溶液、乙腈配制成定溶液。

1.3 样品前处理

准确称饲料2.00 g于塑料离心管中，添加10.00 mL提取液，匀浆机10 000g匀浆1 min，摇床振荡30 min，10 000g离心5 min。分取4.00 mL提取液到含40 mg多壁碳纳米管的离心管，涡旋1 min后再10 000g离心5 min；移2.50 mL上清液在水浴40 ℃条件下氮吹近干，用1 mL定溶液溶解残液，转移至2 mL离心管中15 000g离心5 min，UPLC-MSMS测定。

1.4 液相色谱条件

柱子为Waters BEH C18，1.7 μm；样品室20 ℃，柱温40 ℃；进样量5 μL。流动相∶乙腈(A)和0.1%(V∶V)甲酸水溶液(B)；梯度洗脱：0～1.5 min，维持10%A；1.5～2.5 min，10%A线性变化至90%A；2.5～7.0 min，维持90%A；7.0～7.1 min，90%A线性变化至10%A；7.1～10 min，维持10%A。

1.5 质谱条件

ESI源(正负同时扫描，MRM)，毛细管电压2.5 KV/-2.0 KV，雾化气1 000 L·h-1，锥孔气50 L·h-1；源温150 ℃；雾化温度500 ℃。各化合物的质谱条件如表1。

表1 MRM质谱采集参数

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的优化

饲料含丰富的蛋白质等营养物质、含水量较低，9种药物中恩诺沙星和金刚烷胺等含酸碱性基团。所以有机相选用乙腈，以沉淀样品中蛋白质等杂质，水相选用加入适量甲酸的水溶液，以提高回收率。本文采用1.2.3节中列出的，乙腈、水、甲酸等按照不同体积配比配制出的3种提取液，对3大类9种药物提取效果进行考察。结果表明，3种提取液，对9种药物的回收率均可达到75%～120%，考虑到样品中药物含量较低，为提高灵敏度便于浓缩，选择体积比90∶9∶1为提取液。

2.1.2 净化材料的选择

饲料提取液中杂质复杂，颜色深黄。为减少仪器基质效应，更好保护仪器，减少污染，筛选了N-丙基乙二胺、C18、多壁碳纳米管等净化材料。以2.1.1优化得到的提取液空白，加入适量浓度9种药物，用不同质量的3种材料进行净化，筛选其净化效果。经过试验证明，4.00 mL提取液3种净化填料在适当质量下，回收率均控制在80%～120%，但是多壁碳纳米管能更有效地去除色素，所以选为净化材料，使用40 mg。

2.2 色谱条件的优化

文中比对了甲醇和乙腈作为有机相，纯水和0.1%甲酸水溶液作为水相，共4组流动相，并对梯度进行了优化。水相为纯水时，恩诺沙星、金刚烷胺和磺胺间甲氧嘧啶等药物峰形均较差，其他药物均可得到满意的灵敏度和峰型；但若水相加入0.1%甲酸时，9种药物均得到满意峰型和灵敏度，乙腈做流动相时大多药物灵敏度优于甲醇，故选择乙腈/0.1%甲酸水作流动相。

2.3 质谱条件的优化

配置成2 mg·L-1的9种药物标液，流动相按照2.2节色谱条件优化所得的流动相。标液通过仪器蠕动泵泵入质谱，电喷雾离子源(ESI)(正负同时扫描)得到母离子，玉米赤霉烯酮为ESI-，得到稳定母离子[M-H]-；其他药物为ESI+，得到稳定母离子[M+H]+。确定母离子之后，再使用waters质谱自带的IntelliStart技术，自动对9种药物子离子及其参数进行优化，得到锥孔电压、碰撞能力等，建立完整的质谱多反应监测(MRM)方法。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应

配合饲料富含多种营养成分，提取液虽经过多壁碳纳米管净化，但剩余杂质仍可能影响药物灵敏度。文中为了评估样液中杂质对药物灵敏度的影响，用流动相起始比例溶液和基质空白，分别配制系列标准溶液，浓度范围为2～100 μg·L-1，计算得到标准曲线和相关系数；并计算得到2个标准曲线的斜率比，见表2。磺胺间甲氧嘧啶、三唑磷、甲草胺、玉米赤霉烯酮为基质增强，呕吐毒素为基质抑制，均超出斜率比0.8～1.2的阈值，样液中含有杂质对药物灵敏度仍有较大影响，所以选择基质标定量。