戴 恩，田 华，李 龙，周 亮，翟国帅

1.云南省烟草公司 昆明市公司，云南昆明 650051；2.北京佰司特贸易有限责任公司，北京 100021

1 烟草花叶病的概述情况

云南是中国最重要、规模最大的“两烟”生产基地，烟草是云南省重要经济支柱之一。云南的高原气候和土壤条件为烟草作物种植提供了良好的天然生态环境，加上科学种植和精心管理，建立和巩固了优质烟叶基地。然而，病毒病的普遍发生严重影响烟叶的产量和质量，造成严重的经济损失，在我国部分烟区已上升为烟草的第一大病害[1-2]。

烟草花叶病毒 （Tobacco mosaic virus，TMV），为RNA病毒，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群[3]。TMV侵染烟草引起的烟草病毒病是我国烟草上发生最普遍、危害最严重的病害之一，广泛分布于我国广大烟区，尤其是南方烟区发生较为普遍且日益加重，一般发病率为5%～20%，给烟草产业造成了巨大的经济损失[4]。目前烟草普通花叶病还没有治疗的特效药，防治时一定要做到“预防为主、综合防治”[5]。

2 烟草花叶病毒的检测方法简介

时间分辨荧光分析法（Time-resolved fluoraimmunoas say，TRFIA）是近年来发展起来的一项新的标记免疫分析技术，使用三价铕离子（Eu3+）螯合物作为示踪剂标记抗体与相应待测抗原特异性结合成抗原抗体复合物，此复合物在增强液中解高后在特定的激发光下发出特定的荧光，以时间分辨荧光纳米颗粒为标记载体和信号输出单元，以特异性抗体为识别单元，使用荧光检测仪对定量检测卡上荧光信号进行读取，当检材中含有目标检测物时，荧光信号随着含量的增加而变化，利用浓度和变化的关系建立的标准曲线进行准确定量。时间分辨荧光定量快速检测技术具有标记物稳定、抗干扰强、检测结果重复性好、操作较简便、检测时间较短的优点，也可用于现场筛查灵敏度高，比胶体金灵敏度高2～3个数量级。

3 材料与方法

3.1 材料

鲜烟叶、烟草花叶病毒荧光定量检测试纸条（试纸条所用耗材见表1），缓冲液、荧光定量检测仪等（实验所用药品及仪器见表2）。

表1 主要耗材

表2 主要仪器、试剂表

3.2 方法

3.2.1 烟草花叶病毒荧光定量试纸条的组装 在PVC支持板上，按顺序黏贴附着固相抗体的硝酸纤维素膜、吸收垫、玻璃纤维素膜、样品垫（图1），膜与垫、垫与垫间留有1～2 mm的重叠，重叠间隙不要留气泡，用剪刀将粘贴好的试纸条剪成宽3 mm左右，常温避光下干燥保存。

图1 荧光定量试纸组装图

3.2.2 样品采集 2021年7月从云南各地7个烟站采集鲜烟叶，共计15 000个样本，将其编号后进行烟草花叶病毒的检测。各个烟站采样情况见表3。

表3 7个烟站采样详情

3.2.3 实验操作步骤 先用天平取0.5g鲜烟草样本至含有缓冲液的1.5 mL离心管中，使用捣棒上下捣10～15次，捣碎。荧光检测仪开机预热几秒，从包装袋中取出试纸条。再用移液器取捣碎的样本液100 L垂直滴于试纸条进样孔中。将滴过液的试纸条插入荧光定量检测仪的样品孔中，然后按测定，最后获得样品中花叶病菌数量，记录数据。

烟草花叶病毒浓度阈值判定的标准是根据agdia的胶体金条进行确定的，浓度阈值3 ng/mL检出为阴性，3～10 ng/mL为弱阳，10～100 ng/mL为中强阳，＞100 ng/mL为强阳。

3.2.4 数据处理 采用Excel 2007软件处理所得数据。

4 结果与分析

对云南省昆明市石林县7个烟站检测结果统计显示，石林烟站样品检测量为2 000个，其中花叶病阳性个数为15个，阳性率为0.75%，相对来说阳性率不高，相关部门应提前做好预警及防控；鹿阜烟站样品检测量为2 000个，其中花叶病阳性个数为96个，阳性率为4.80%，相对来说阳性率处于可控制范围内，相关部门需做好预警及防控；长湖烟站样品检测量为2 500个，其中花叶病阳性个数为5个，阳性率为0.20%，相对来说阳性率不高，仍需做好预警和防控；西街口烟站样品检测量为2 000个，其中花叶病阳性个数为33个，阳性率为1.65%，相对来说阳性率处于可控范围，仍需做好预警和相关防控；大可烟站样品检测量为2 000个，其中花叶病阳性个数为55个，阳性率为2.75%，相对来说阳性率处于可控范围，仍需做好预警和相关防控；板桥烟站样品检测量为2 000个，其中花叶病阳性个数为643个，阳性率为32.15%，阳性率相对其他几个烟站是最高的，因此板桥烟站需引起重视，做好预警方案和防控措施，避免花叶病扩散，有必要的话可更换烟草品种或实行轮作制度；圭山烟站样品检测量为2 500个，其中花叶病阳性个数为5个，阳性率为0.20%，相对来说阳性率不高，仍需做好预警和相关防控。

7个烟站阳性率的大小依次为：板桥烟站＞鹿阜烟站＞大可烟站＞西街口烟站＞石林烟站＞长湖烟站、圭山烟站。此次采集云南省昆明市石林县7个烟站样品量共15 000个，其中阳性个数为852个，阳性概率为5.68%（表4、图2）。

图2 7个烟站花叶病检测数据统计图

表4 7个烟站烟叶病害检测汇总表

5 讨论

云南烟草常年种植面积超过35万hm2，超过全国的1/3。近年来，烟草病毒病已经成为烟草病虫害中损失最大的一类病害[6]。2003年云南省烟草因病毒病造成的损失达4 800多万元[7]。因此，烟草病毒病害的防治成为烟草植保工作的首要任务。我国在该病毒的检测方法上主要有PCR法。本次通过荧光定量快速检测法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、检测速度快、检测成本低的优点，为烟草花叶病病害提供了快速、准确的检测手段，并建立了烟草花叶病病毒数据分析和模型。

6 结论

（1）通过荧光定量快速检测法，对云南省昆明市石林县7个烟站的样品进行花叶病病害检测，建立了云南省烟草公司昆明市公司烟叶病害花叶病数据库，根据检测数据结果统计分析，建立烟草花叶病病毒病的预警机制及防控措施。

（2）时间分辨荧光法快速检测试纸条检测烟草花叶病毒阈值判定的标准是根据agdia的胶体金条进行确定的，阈值定为3 ng/mL时与agdia的胶体金条阴阳性能完全符合，且检测时间只需10 min，可用于对TMV的定量检测，适合用于实验室或田间对TMV感染症状的研究及评估，满足对TMV更高灵敏度检测的需要。

（3）建立烟叶病害大数据库，建立大数据技术的战略意义在于对庞大的、含有意义的数据进行专业化处理，是实时交互式的查询效率和分析能力。对烟草病害来说，建立数据库需前期对各地的烟草品种进行大量检测，归纳整理，以期发现一定规律，便于制定适合各地烟草品种相关病害预防、控制、管理方案。