刘文志， 郭立平， 张倩璐

(南华大学第一附属医院麻醉科，湖南 衡阳 421001)

肺动脉高压(pulmonary hypertension, PAH)是一种以肺部血管重构和右心室肥大为特征的恶性疾病，可促进早期右心衰，严重者可致病人死亡。PAH的发病机制包括肺动脉收缩异常，结构性血管重塑以及病理性纤维化和硬化等[1]。肺血管重塑是指由于肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)和成纤维细胞等异常增殖与肥大，以及细胞外间质分泌增多，引起的肺动脉壁增厚和肺循环阻力增大，这是PAH发生的关键性病理改变[2]。另一方面，PAH病人血管呈弥漫性炎性浸润，其血浆中诸多促炎因子，例如白介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18 和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等的水平均显著升高[3]。另外，缺氧被证实可通过诱导PASMCs分泌多种炎症因子，促进PASMCs异常增殖和PAH肺血管重构[4, 5]，提示PAH病情发展与PASMCs炎症反应密切相关。细胞焦亡是近年来发现的由消皮素家族(gasdermins，GSDMs)所介导，依赖胱天蛋白酶(caspases)家族活性的程序性细胞死亡，其特征是细胞膜表面形成多处孔洞，使胞内外渗透压有显著差异，细胞发生肿胀直至破裂。此过程伴随大量的促炎因子释放(主要是IL-1β和IL-18)，并募集周围炎性细胞导致持续性炎症反应[6]。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和胱天蛋白酶1前体(pro-caspase-1)组成的NLRP3炎性小体，在焦亡发生中扮演重要角色。当内外环境改变致该炎性小体激活时，胱天蛋白酶1前体会活化为成熟胱天蛋白酶1，进一步切割IL-1β和IL-18前体，促进成熟IL-1β和 IL-18的产生和释放[7]。最近，Zhang等 人[8]构建出缺氧性PAH大鼠模型，发现其肺动脉中膜存在较为明显的细胞焦亡，体外缺氧诱导PASMCs也有类似现象。另外，PAH大鼠在用胱天蛋白酶1抑制剂处理，其血管重构、右心室收缩压和右心室肥厚等均明显改善，这提示抑制PASMCs焦亡，对防治肺血管重塑和PAH有重要意义，但有关PASMCs焦亡的具体机制仍不甚清楚。

异氟醚(isoflurane)作为一种强效吸入性麻醉剂，可通过扩张外周血管，降低灌注压和外周血管阻力，对心肺功能起显著性保护效应[9]。Roehl等人[10]构建了猪急性PAH模型，发现异氟醚预处理可显著降低猪肺动脉压，以及血液中TNF-α和IL-6水平。与此类似，覃等人[11]报道，在心肺联合移植术后的猪体内，异氟醚持续预吸入可显著降低肺平均动脉压，肺毛细血管嵌压和中心静脉压，说明异氟醚麻醉对由缺血再灌注损伤引起的PAH有一定保护作用。此外，证据显示，异氟醚吸入麻醉可减少肝细胞内胱天蛋白酶1/胱天蛋白酶11表达，通过经典途径和非经典途径抑制肝细胞焦亡和炎症，进而减轻小鼠体内肝缺血再灌注损伤[12, 13]。鉴于PASMCs焦亡和炎症紊乱在PAH中的重要作用，本研究聚焦于异氟醚对PASMCs焦亡的影响及潜在机制，为阐明异氟醚的抗PAH机制提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人PASMC细胞购于美国Sciencell公司(#3110)；DMEM高糖培养基(#A4192101)、胎牛血清(FBS，#10100147)、胰酶/EDTA(#25200072)和Opti-MEM减血清培养基(#31985062)购于美国Gibco公司；HEPES溶液(#C0215)、脱脂奶粉(#P0216)、青霉素-链霉素溶液(#C0222)、RIPA细胞裂解液(#P0013B)、PMSF(#ST506)、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(#C0016)、胱天蛋白酶1活性检测试剂盒(#C1102)、活性氧抑制剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，#S0077)、BCA蛋白质定量试剂盒(#P0012S)、人TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒(#PT518，#PI330)购于上海碧云天公司；胞浆蛋白质提取试剂盒(#BC3740)、核蛋白质提取试剂盒(#R0050)、总蛋白质提取试剂盒(#BC3711)、 ROS检测试剂盒(#CA1410)、人IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒(#SEKH-0002，#SEKH-0028)购自北京索莱宝公司；总RNA提取纯化试剂盒TRIzol? Plus RNA Purification Kit(#12183555)，TaqMan? 逆转录试剂盒(#N8080234)、Lipofectamine 3000(Lipo3000)转染试剂(#L3000008)购自美国ThermoFisher公司；Nrf2 siRNA(Nrf2 siRNA)和对照scrambled siRNA序列由上海吉玛基因合成；Hoechst 33342/PI双染试剂盒(#BL116A)购自Biosharp公司；Nrf2(#ab137550)、HO-1(#ab52947)、NLRP3(#ab270449)、胱天蛋白酶1(#ab286125)、ASC(#ab151700)、GSDMD(#ab219800)和β-肌动蛋白(#ab115777)兔抗人一抗购自英国Abcam公司；α-微管蛋白(#2144)、Histone H3(#4499)兔抗人一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(#7074)购自美国CST公司；Western印迹超敏发光试剂盒Pierce ECL Plus(#CW0049)购自北京康为世纪生物公司。

1.2 人肺动脉平滑肌细胞培养

人PASMCs用含20%胎牛血清，1%青霉素-链霉素，10 mmol/L HEPES的DMEM培养液中培养。细胞分为常氧组、缺氧组和及缺氧+异氟醚组：(1)常氧组：将细胞置于37 ℃、21% O2、5% CO2条件下静置培养；(2)缺氧组：将细胞置于37 ℃、3%O2、5%CO2条件下静置培养24 h；(3)缺氧+异氟醚组：调整培养箱内混合气体浓度3%O2、5%CO2和2%异氟醚，37 ℃下静置培养24 h。

1.3 siRNA转染

按照说明书中提供的步骤，利用Lipo3000将Nrf2 siRNA和对应的scrambled siRNA转染至PASMCs中。具体如下：转染前24 h，细胞铺于24孔板，密度控制在0.5×105～2×105。待细胞70%～80%融合，用150 μL Opti-MEM减血清培养基稀释20 pmol siRNA溶液，混匀，标记为A液；同体积Opti-MEM培养基稀释1 μL Lipo3000溶液，混匀，标记为B液。A液和B液于室温下放置5 min，将二者充分混合，再室温放置5 min，此即为siRNA-脂质体混合物，标记为C液，细胞于400 μL/孔无血清培养基中37 ℃孵育6 h，换成完全培养基，再于培养箱中放置48 h。提取细胞总蛋白，应用Western印迹检测Nrf2基因沉默效果。siRNA序列由上海吉玛公司合成，Nrf2 siRNA的序列为5′-GUCAGCGACAGAAGGAUUATT-3′，scrambled siRNA的序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.4 蛋白质印迹检测

细胞经相应处理或转染，丢弃培养液，4 ℃ PBS洗3次。将RIPA裂解液与PMSF溶液按100∶1体积混合，总体积100 μL。将细胞置于冰上，加入配置好的细胞裂解液。孵育20 min，用细胞刮将细胞轻轻刮下。收集裂解后的细胞液，于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白质浓度，将蛋白质煮沸8 min以变性，置于-20 ℃保存备用。根据测得的蛋白质浓度，取适量蛋白质行SDA-PAGE凝胶电泳分离(浓缩胶80 V 30 min，分离胶120 V 1.5 h)，行湿转法使蛋白质转移至PVDF膜。用TBST液配置5%脱脂牛奶，将PVDF膜封闭4 h，分别孵育Nrf2、Kepa1、HO-1、NLRP3、胱天蛋白酶1、ASC、GSDMD、β-肌动蛋白 一抗(稀释比例均为1∶1 000), 置摇床4 ℃摇动过夜。次日用 TBST洗膜(5 min/次，4次)，与HRP标记羊抗兔二抗共孵育(稀释比例1∶5 000)，4 ℃摇动2 h，TBST洗膜(5 min/次，4次)，最后用ECL发光试剂盒显影成像，Image J 软件(version 1.53)分析蛋白质条带灰度值。

1.5 RNA提取和逆转录聚合酶链式反应

细胞经相应处理或转染，按Trizol试剂盒中的步骤提取总RNA。测定纯度和浓度，利用TapMan逆转录试剂盒将1 μg RNA反转录为cDNA，按照说明书配置相应的反应体系[14]。于StepOnePlusTM实时荧光定量 PCR系统(Applied Systems)进行链式反应。PCR反应参数为：预变性(95 ℃，10 min)、变性(97 ℃，15 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，50 s)，进行40个循环。得出溶解曲线统计Ct值。以 β-肌动蛋白为内参进行分析，用2-ΔΔCt法来计算目的基因相对表达量，每个样品均重复 3 次。所用到的引物序列如下：NLRP3 上游，5′-GGACTGAAGCA CCTGTTGTGCA-3′和下游，5′-TCCTGAGTCTCCCA AGGCATTC-3′；ASC上游，5′-AGCTCACCGCTAA CGTGCTGC-3′和下游，5′-GCTTGGCTGCCGACTGA GGAG-3′；GSDMD上游，5′-ATGAGGTGCCTCC ACAACTTCC-3′和下游，5′-CCAGTTCCTTGGAGAT GGTCTC-3′；β-actin上游，5′-CACCATTGGCAA TGAGCGGTTC-3′和下游，5′-AGGTCTTTGCGG ATGTCCACGT-3′。

1.6 活性氧活性检测

细胞经相应处理或转染后，用DCFH-DA 作为荧光探针，检测细胞内ROS水平[15]，具体步骤如下：DCFH-DA用无血清DMEM培养液按1∶1 000稀释，使终浓度为 10 μmol/L。收集细胞，离心，弃培养基，使细胞悬浮于0.5 mL 和1 mL稀释好的 DCFH-DA溶液中，密度控制在1×106～2×107/mL。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，孵育20 min，期间每隔 3～5 min 颠倒混匀，使细胞和探针充分接触。为防止液体本底荧光强度过高，用无血清DMEM培养液洗涤细胞3次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。利用荧光分光光度计(PerkinElmer FL6500)，在 488 nm激发波长、525 nm 发射波长条件下检测荧光强度。

1.7 乳酸脱氢酶释放率检测

细胞LDH释放水平，根据LDH细胞毒性检测试剂盒提供的步骤进行。具体如下：将细胞接种到96孔细胞培养板中(200 μL/孔)，待细胞70%～80%融合，PBS洗涤，更换无血清培养基。经相应处理或转染，将细胞培养板用多孔板离心机离心(400 g，5 min)。分别取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相应孔中。加入LDH检测试剂(60 μL/孔)，反复吹打数次混匀，25 ℃避光孵育30 min。酶标仪(ThermoFisher Multiskan FC)检测 490 nm 处各孔的吸光度(OD)。根据公式LDH释放率(%)=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-对照样品吸光度)×100%，计算出各组细胞培养液上清中的LDH含量。

1.8 胱天蛋白酶1活性检测

胱天蛋白酶1活性检测根据其活性检测试剂盒中的步骤进行。其原理是底物 Ac-YVADpNA 可在胱天蛋白酶1催化下生成黄色的 pNA，故检测 pNA含量即可反应胱天蛋白酶1活性。细胞经相应处理或转染后，选取对数生长期细胞，胰酶消化，600 g 4 ℃离心5 min，收集细胞，加入试剂盒提供的裂解液，冰浴裂解15 min。12 000 g 4 ℃离心10 min，小心取上清，转移到冰浴预冷的离心管中。BCA法测定蛋白质浓度。将等量上清液样品(含30 μg 蛋白质)置于 96 孔板，加入10 μL Ac-DEVD-pNA ，混匀，37 ℃ 下孵育2 h，酶标仪检测 405 nm 处A值，得出所生成的pNA含量。将未处理组设为对照组，其胱天蛋白酶1活性设为 1，得出不同处理/转染后细胞胱天蛋白酶1的相对活性。

1.9 酶联免疫吸附试验

ELSA(enzyme-linked immunosorbent assay)试验根据试剂盒(含抗体预包被酶标板)中提供的步骤进行。具体如下：细胞经相应处理或转染后，将培养液移至无菌离心管，1 000 g 4 ℃离心10 min，取上清并等量分装至小EP管中，4 ℃保存备用。ELISA检测前 30 min，将试剂盒、待测上清液放置于室温下回温。用试剂盒内的标准品稀释液对标准品和上清液进行梯度稀释，并按说明书要求将浓缩洗涤液(20×)用双蒸水稀释，配置成洗涤工作液。加入标准品/上清液前，用洗涤液洗板3次(300 μL/孔)，吸水纸上拍干。加入100 μL 不同浓度的标准品及上清液样本依次加入反应孔中，胶纸封板，37 ℃孵育90 min，洗板4次、拍干。再向反应孔中加入100 μL生物素化抗体工作液，胶纸封板，37 ℃孵育60 min，洗板4次、拍干。再加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中，胶纸封板，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次、拍干。再加入100 μL显色底物至反应孔中，胶纸封板，37 ℃避光显色15 min，最后加入50 μL终止液终止反应。酶标仪检测 450 nm 处A值，制作标准曲线，进行后续分析。

1.10 Hoechst/ PI染色法检测肺动脉平滑肌焦亡

将PASMCs种植于6孔板中，经相应处理或转染，PBS溶液漂洗3次，分别加入 5 μL Hoechst 33342 工作液和5 μL PI工作液，轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min。PBS溶液漂洗2次，使用荧光显微镜下观察细胞焦亡情况。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 异氟醚处理对缺氧诱导的NOD样受体蛋白3炎性小体激活和肺动脉平滑肌细胞焦亡的影响

研究表明，缺氧可诱导肺血管痉挛以及不可逆重构，这是PAH发生的重要因素[16, 17]。首先检测了缺氧对人PASMCs焦亡的影响。采用3%O2缺氧处理PASMCs 24 h，RT-PCR和Western 印迹法检测焦亡相关蛋白质表达，胱天蛋白酶1活性试剂盒检测其活性，LDH细胞毒性试剂盒检测细胞LDH释放水平，ELISA检测培养基上清IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α分泌。结果表明，与常氧组细胞相比，缺氧组细胞NLRP3、ASC、GSDMD的mRNA和蛋白质表达水平均显著上升(P<0.0001，Fig. 1A, B)，切割胱天蛋白酶1蛋白水平显著升高(P<0. 0001，Fig. 1B)，胱天蛋白酶1活性增强(P<0. 01，Fig. 1C)，LDH释放率增加(P<0. 01，Fig. 1D)，培养基中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α分泌量明显增加(P<0. 0001, Fig. 1E)，Hoechst/ PI染色显示，焦亡孔洞形成增加(Fig. 1F)。而异氟醚处理后，缺氧引起的上述指标均有不同程度下调(P<0. 05，Fig. 1)。这些结果提示，异氟醚能减轻缺氧诱导的NLRP3炎性小体激活和PASMCs焦亡。

2.2 异氟醚通过减少活性氧生成以缓解缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞焦亡

众多文献报道，细胞内ROS生成过多与NLRP3炎症小体激活和焦亡发生密切相关[18, 19]。本文探讨了异氟醚缓解缺氧诱导的PASMCs焦亡是否与ROS有关。采用3%O2缺氧处理PASMCs，异氟醚处理/不处理24 h，ROS检测试剂盒检测胞内ROS生成。另外，用ROS抑制剂NAC预处理PASMCs缺氧模型，检测焦亡相关蛋白质表达，胱天蛋白酶1活性，LDH释放，培养基上清炎症因子分泌以及焦亡孔洞形成等指标。结果表明，PASMCs经缺氧处理后，胞内ROS生成增加了约3.36倍，而异氟醚可显著减少缺氧诱导的ROS生成(P<0. 01，Fig. 2A)。进一步，用NAC预处理PASMCs，异氟醚缓解PASMCs焦亡的现象则更加明显，体现在焦亡相关蛋白质表达进一步减少，胱天蛋白酶1活性降低，LDH释放水平下降，IL-1β和IL-18等促炎因子分泌量减少(P<0. 05，Fig. 2B-F)，焦亡孔洞形成进一步减弱(Fig. 2G)。这些现象证实，异氟醚是通过减少胞内ROS生成来减轻缺氧诱导的PASMCs焦亡。

Fig.2 Inhibition of ROS production is responsible for the suppressive effects of isoflurane on NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis in human PASMCs For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. (A) Cellular ROS levels were detected using a ROS assay kit. (B-F) Cells were pre-incubated with 2 mmol/L NAC for 2 hours, then they were hypoxic and/or treated with isoflurane. The mRNA and protein levels of pyroptosis-related factors were detected by RT-PCR (B) and Western blots (C). Caspase-1 activity was measured using a caspase-1 activity assay kit (D). LDH release was evaluated by LDH cytotoxicity assay kits (E). The secretion levels of IL-1β, IL-18, IL-6 and TNF-α in culture medium were assessed by ELISA kits (F); (G) Pyroptosis in PASMCs as observed by Hoechst/PI staining (scale bar is 20 μm). *P<0. 05, **P<0. 01, ***P<0.001,****P<0. 0001. n=3

2.3 异氟醚可促进缺氧肺动脉平滑肌细胞内核转录因子2核转位和血红素加氧酶1表达

核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)被证明是细胞内抗氧化和抗炎症损伤的关键调节因子，在PAH等多种疾病中扮演有益角色[20]。生理条件下，胞质中Nrf2与其特异性阻遏蛋白Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)结合，通过泛素-蛋白酶体途径被降解。而病理情况下，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)等结合，诱导细胞保护基因的转录，以清除ROS等有害物质。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是Nrf2特异性靶基因之一，也是一种重要的抗氧化酶[21]。本文检测了异氟醚对Nrf2/HO-1信号通路的影响。PASMCs经缺氧/异氟醚处理24 h，Western印迹法检测Nrf2和HO-1表达。结果显示，与常氧组细胞相比，缺氧组细胞胞浆Nrf2表达升高，核内Nrf2表达降低(P<0.01, Fig. 3A，3B)，胞内HO-1表达减少(P<0.001, Fig. 3C)，而异氟醚处理可显著抵消缺氧引起的Nrf2和HO-1的表达变化(P<0.01, Fig. 3)。这些发现提示，异氟醚可激活缺氧PASMCs内Nrf2/HO-1信号通路。

Fig.3 Isoflurane promotes Nrf2 nuclear translocation and elevates the expression of HO-1 in hypoxic human PASMCs For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. (A, B) Cytoplasmic and nuclear Nrf2 expressions were detected by Western blotting. (C) The protein levels of HO-1 were detected by Western blotting. **P<0. 01, ***P<0.001, ****P<0. 0001. n=3

2.4 异氟醚通过激活Nrf2/HO-1通路减少活性氧生成和肺动脉平滑肌细胞焦亡

为了进一步证实异氟醚通过Nrf2/HO-1通路清除ROS，本文将Nrf2 siRNA转染入PASMCs，或者用HO-1特异性抑制剂锌原卟啉(Znpp)预处理PASMCs，再将PASMCs经缺氧/异氟醚处理24 h，检测ROS生成。结果表明，转染Nrf2 siRNA后，胞内Nrf2水平下降了86%，提示转染效果较好(P<0.001，Fig. 4A)。另外，异氟醚减少PASMCs内ROS生成的效应可被Nrf2 siRNA或Znpp预处理大部分抵消(P<0.05，Fig. 4B)。本文进一步分析了沉默Nrf2对PASMCs焦亡的影响。结果表明，Nrf2 siRNA转染后，异氟醚缓解PASMCs焦亡现象则被显著抵消(P<0. 05，Fig. 4C-G)，这些结果证实，异氟醚通过激活Nrf2/HO-1通路以减少缺氧PASMCs内ROS生成和PASMCs焦亡。

Fig.4 Isoflurane decreases ROS production in human PASMCs by activating the Nrf2/HO-1 pathway For normoxia experiments, cells were incubated in a humidified incubator with a constant supply of air(21% O2)with 5% CO2 at 37℃. For hypoxia/isoflurane experiments, cells were placed in a special hypoxia incubator with a gas mixture of air(3% O2), 5% CO2 with or without 2% isoflurane at 37℃ for 24 hours. Cells were transfected with 20 pmol/L Nrf2 siRNA or pre-treated with 10 μmol/L Znpp. (A) Western blotting was used to detect the transfection efficiency of Nrf2 siRNA. (B) Cellular ROS levels were detected using a ROS assay kit; (C, D) The mRNA and protein levels of pyroptosis-related factors were detected by RT-PCR and Western blotting; (E) Caspase-1 activity was measured using a caspase-1 activity assay kit; (F) LDH release was evaluated by LDH cytotoxicity assay kits; (G) The secretion levels of IL-1β, IL-18, IL-6 and TNF-α in culture medium were assessed by ELISA kits. ns, no significance, *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001. n=3

3 讨论

PASMCs在PAH的病情发展中扮演重要角色。PASMCs的异常迁移、增殖和凋亡等均会促使肺动脉发生不可逆重构，导致PAH发生[22]。在PAH病人体内，血清IL-1β[23]、IL-6[24]、IL-8[24]、TNF-α[24]等水平以及PASMCs中IL-18表达均显著上升[24]，而用抑制剂阻断相关炎症因子能显著遏制PAH病情进展[25]。最近，Zhang等人[8]发现，在患有缺氧性PAH的病人和小鼠体内，其肺动脉中膜有明显的焦亡发生，体现在IL-18, 胱天蛋白酶1和高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)等焦亡相关因子的表达明显升高，而对PAH小鼠注射胱天蛋白酶1抑制剂，其PAH的病情进展显著缓和，证明细胞因子驱动的炎症过程以及PASMCs焦亡与PAH的发生发展密切相关。另外，异氟醚作为一种常用的吸入性麻醉剂，被报道在PAH和肺心病等疾病中发挥有利作用[26]，但机制未知。本研究发现，对人PASMCs进行缺氧处理，其焦亡水平显著上升(Fig. 1)，这与前人研究结果一致，而异氟醚处理可显著减轻缺氧PASMCs焦亡(Fig. 1)，提示异氟醚的心肺保护效应可能与抑制PASMCs焦亡有关。

细胞焦亡的发生机制复杂，胞内ROS生成过多导致的氧化还原异常与NLRP3炎性体激活和焦亡发生最为密切。Wu等人[27]发现，尼古丁可通过ROS依赖性的方式激活血管内皮细胞内的NLRP3炎性小体，进而促进细胞焦亡和动脉粥样硬化的发生发展，而当细胞用ROS抑制剂NAC处理后，这些效应被显著抵消。甲基莲心碱可通过抗氧化效应，清除胞内过多生成的ROS，阻断LPS-ATP诱导的NLRP3/caspase-1信号通路激活，进而抑制内皮细胞焦亡[28]。与此类似，香烟烟雾提取物(CSE)可通过NLRP3/caspase-1通路诱导人支气管上皮细胞焦亡。而阻断胞内的ROS生成，NLRP3炎性体活化以及细胞焦亡均明显减弱，提示CSE的促上皮细胞焦亡效应须ROS参与[29]。另外，异氟醚被发现有清除细胞内ROS的功能。Yao等人[30]报道称，对脑动脉闭塞的小鼠进行异氟醚亚麻醉，其小胶质细胞和神经元活性显著增强，脑损伤明显恢复。从机制而言，异氟醚可通过减少胞内ROS含量，阻断ROS依赖的p38 MAPK/NF-κB信号通路激活，减轻细胞炎症和凋亡。Yin等人[31]研究发现，异氟醚可通过清除肺泡巨噬细胞内过多生成的ROS，抑制NLRP3炎性体和胱天蛋白酶1活性，以及细胞焦亡发生，进而改善家兔急性肺损伤。类似的，Li等人[32]发现，异氟醚亚麻醉可通过降低中性粒细胞内过量的ROS，抑制NF-κB核转位和MAPK通路激活，进而减少胞内NO/ONOO-释放和肺微血管内皮细胞蛋白质渗出，改善肺功能。本文的研究发现，缺氧PASMCs内ROS水平显著升高，而经异氟醚处理，ROS水平降低。另外，用ROS抑制剂NAC预处理PASMCs，异氟醚减轻PASMCs焦亡的效应被进一步放大(Fig. 2)，证实异氟醚可通过减少PASMCs内ROS含量，改善缺氧PASMCs的功能障碍，这与先前的报道也基本相符。

Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链(leucine zippers, bZIP)转录因子，属于CNC(Cap′N′ Collar)家族。生理情况下，Nrf2活性被Keap1抑制，其核转位受阻。而病理情况下，Nrf2与Keap1发生解离，核转位增加，与核内ARE结合后，有助于清除胞内ROS，并促进多种细胞保护因子的转录[33]。葛等人[20]通过低氧诱导建立PAH大鼠模型，发现用Nrf2激活剂莱菔硫烷灌胃，可显著促进大鼠肺动脉组织中Nrf2核转位，升高丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性，改善肺血管重构和右心肥大，提示Nrf2是防治PAH的有效靶点。He等人[34]通过在SD大鼠中构建缺氧性PAH模型，发现茯苓酸可显著改善肺动脉血流动力学参数，肺血管重塑以及右心肥厚。就机制而言，茯苓酸可以通过Nrf2-Keap1-ARE通路，清除PASMCs中过多生成的ROS，抑制细胞的异常增殖和凋亡。另外，Abramo等人研究发现，在Nrf2敲除(Nrf2-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞内，其线粒体ROS的生成量显著增加[35]。没食子酸，一种广泛分布于植物中的活性酚酸，可通过Nrf2依赖性的方式减少巨噬细胞内ROS生成，抑制NLRP3炎性小体激活和细胞焦亡[36]。本研究发现，异氟醚可以通过促进缺氧PASMCs内Nrf2的核转位，增加HO-1的表达(Fig. 3)，阻断Nrf2或HO-1时，异氟醚减少PASMCs内ROS生成的效应被显著抵消，并且Nrf2沉默可显著抵消异氟醚的抗焦亡效应(Fig. 4)，这说明异氟醚可通过激活Nrf2/HO-1通路，清除胞内过多的ROS，缓解PASMCs焦亡。综上所述，本研究在体外较深入地挖掘了异氟醚缓解缺氧PASMCs焦亡的分子机制及其与氧化还原反应之间的联系，而类似的现象是否也在PAH动物模型中存在，仍须进一步设计实验探讨。