路振香，王 东，洪皓正，王 浩，王 奇，周 明，郭伟娜,2，刘 畅,2，张 宁，李贺侠

(1.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100；2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽凤阳 233100；3.南京市栖霞区动物卫生监督所，江苏南京 210046；4.安徽省和县动物疫病预防与控制中心，安徽和县 238200)

志贺氏菌(Shigella)包括痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌，其中痢疾志贺氏菌引起的痢疾发病迅速，表现强烈；福氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌是导致人类痢疾的主要流行菌型。志贺氏菌感染力强[1]、耐药严重、多重耐药菌株不断出现[2]。志贺氏菌可引起腹泻和发热性痢疾，严重者可出现神经症状和伴发败血症。近年来，猕猴[3]、鸡[4]、牦牛[5]、羊[6]等动物感染志贺氏菌报道也在增多。本文对2020年9月安徽滁州某养鹅户送检的以体温升高、精神沉郁、排灰白色或黄白色的稀薄粪便以及肠道广泛出血、胰腺出血、脾脏淤血而表面呈斑驳样、肝脏稍微肿大的18日龄病死鹅进行病原菌的分离鉴定、耐药及毒力基因检测，为该病实验室诊断和养殖户用药治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 养殖户送检的主要以体温升高、精神沉郁、采食量下降以及排灰白或者黄白色稀粪、头颈震颤为主要特征的18日龄病死鹅6只，采取其肝脏作为病料。

1.1.2 试剂 DNA marker DL 2 000、PremixTaq，宝生物工程(大连)有限公司产品；药敏纸片(批号2021015)，杭州滨和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 台式高速离心机(H3-18K)，湖南可成仪器设备有限公司生产；梯度PCR仪，北京东胜兴业科学仪器有限公司生产；全自动数码凝胶图像分析仪，上海天能科技有限公司生产；电泳仪，北京君意电泳设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分离菌分离培养和形态观察 无菌操作蘸取病死鹅的肝脏组织分别划线接种于LB琼脂和麦康凯琼脂平板，37℃培养18 h～24 h，将培养出的单个典型菌落进行纯化、革兰氏染色，油镜下观察。

1.2.2 分离菌生化试验、16S rRNA序列PCR扩增、测序及同源性分析 参照文献[7]对分离菌分别进行糖发酵试验，VP试验，甲基红试验以及吲哚形成试验。细菌通用引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：GGTTAACCTTGTTACGACTT，由通用生物技术(安徽)有限公司合成。PCR反应体系： PremixTaq25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，细菌DNA模板2 μL，补充超纯水至总体积50 μL。PCR反应程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，46℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，15℃结束反应。取PCR扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳(110 V电泳30 min)，于凝胶成像系统成像，观察记录结果，下同。将PCR产物送去通用生物技术(安徽)有限公司进行测序。将测序结果在GenBank上比对，同源性分析，并建立进化树。

1.2.3 分离菌药物敏感试验和耐药基因检测 参照文献[8]用11种抗生素对分离菌进行测试。根据文献[9-10]设计5对分离菌的耐药基因引物，引物由通用生物技术(安徽)有限公司合成(表1)。参照1.2.2的方法将反应体系总体积减半即25 μL，5对耐药基因PCR体系与条件均相同，其PCR反应条件为:95℃ 5 min；94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，15℃结束反应。10 g/L琼脂糖电泳，观察记录结果。

1.2.4 分离菌毒力基因检测 按文献[11]设计5对福氏志贺氏菌毒力基因引物，引物由通用生物技术(安徽)有限公司合成(表2)。PCR反应体系同1.2.3。反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸10 min，15℃结束反应。10 g/L琼脂糖电泳，观察记录结果。

表1耐药基因及其序列

表2毒力基因及其引物序列

2 结果

2.1 分离菌革兰氏染色、生化试验、16S rRNA PCR扩增结果

从病死鹅体内分离到1株革兰氏阴性单个散在细小杆菌，该菌在麦康凯琼脂平板上为无色至淡粉色圆形半透明、光滑、湿润的小菌落；在营养琼脂平板上为灰白色圆形微隆起、光滑湿润半透明小菌落。该菌能利用葡萄糖只产酸，不能利用乳糖和蔗糖，甲基红试验为阳性，吲哚及VP试验均为阴性。分离菌扩增出了与预期片段大小一致的目的基因(图1)。

2.2 分离菌16S rRNA系统进化树建立

将测序结果在GenBank上比对，该菌与登录号为NR-026331.1福氏志贺杆菌同源性高达99.38%，因此该菌为福氏志贺氏菌。选取10株与该菌同源性较高的福氏志贺氏菌构建进化树(图2)。

M.DNA标准DL 2 000; 1.分离菌M.DNA Marker DL 2 000; 1.Isolate

2.3 分离菌药物敏感试验结果

该菌对头孢西丁、头孢曲松、头孢哌酮舒巴坦及头孢噻呋钠敏感性最高，对卡那霉素类(阿米卡星)及磺胺类药物(复方新诺明)具有抵抗力(表3)。

图2分离菌16S rRNA基因系统进化树

2.4 分离菌耐药、毒力基因PCR扩增结果

该分离菌含有卡那霉素类耐药基因aadA1、β-内酰胺酶类耐药基因blatem-1、磺胺类耐药基因Sul1(图3)。能扩增出编码多重调控蛋白的vira基因、编码黏附与侵入Ia1基因以及编码志贺氏菌肠毒素1的set1B基因(图4)。

表3分离菌药物敏感试验结果

M.DNA标准DL 2 000; 1～3.aadA1、blatem-1、Sul1DNA Marker DL 2 000; 1-3.aadA1,blatem-1,Sul1

M.DNA标准DL 2 000; 1～3.vira、Ia1、Set1BM.DNA Marker DL 2 000; 1-3.vira,Ia1,Set1B

3 讨 论

本文从送检病死鹅的肝脏组织中分离到1株革兰氏阴性细小分散存在的杆菌，同源性分析可知，该菌为福氏志贺氏菌。该分离菌的培养特性及生化试验结果与福氏志贺氏菌相符。该分离菌对头孢西丁、头孢曲松、头孢哌酮舒巴坦和头孢噻呋钠等头孢菌素类药物敏感，对米诺环素、恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素以及左氧氟沙星等药物敏感性较低，对阿米卡星及复方新诺明不敏感。该分离菌含有卡那霉素耐药基因aadA1、β-内酰胺酶类耐药基因blatem-1以及磺胺类耐药基因Sul1。

福氏志贺氏菌的致病作用主要来自该菌本身的内毒素和侵袭力，本试验对分离菌进行5种毒力基因的PCR扩增，结果该菌含有编码多重调控基因调控蛋白基因vira，编码黏附与侵入肠黏膜细胞肠毒性因子基因Ia1以及编码志贺氏菌肠毒素1基因set1B，即该株分离菌含有多个毒力基因。该群鹅主要临床症状包括体温升高，排黄白色糊状稀粪，采食量下降或者不食，精神萎靡；主要病理变化为肝脏、脾脏、肾脏稍微肿大，淤血，肠道广泛出血，肠道空虚，气囊混浊，这些临床症状及病理变化与其毒力基因的存在有直接关系。