朴兆佳， 于海业， 张郡赫， 周海根， 刘 爽， 孔丽娟， 党敬民

吉林大学生物与农业工程学院， 吉林 长春 130022

引 言

小麦是我国的主要粮食作物， 其产量占粮食总产量的五分之一左右， 在国民经济发展中具有举足轻重的地位[1]。 然而， 随着全球气候变暖， 海平面上升， 耕地盐渍化问题日趋明显。 我国耕地面积约3460万hm2， 发生盐渍化的土壤近760万hm2[2]。 土壤的盐渍化， 导致小麦产量明显降低。 与此同时， 小麦在生长期间经常遭遇昆虫取食。 全国农业技术推广服务中心制定的《2020年小麦玉米油菜重大病虫害防控技术方案》指出， 我国小麦主要产区虫害发生达3.8亿亩次。 昆虫通过对小麦叶片和茎秆等部位进行刺吸和咬食， 极易造成物理损伤， 进而影响小麦光合作用及营养的吸收和传导[3]。 由此可见， 盐和物理损伤胁迫已经对小麦健康生长和最终产量造成了严重的影响。 研究表明， 细胞壁是植物细胞直接抵御逆境胁迫的重要防线。 盐胁迫下， 细胞渗透压增大， 质膜的透性会受到一定程度的影响。 为了维持细胞的形态和结构， 植物细胞壁中的果胶等多糖物质会发生不同程度的转化和改变[4]。 物理损伤， 会加深植物细胞膜脂过氧化的程度， 使膜通透性增大， 导致营养物质的流失和降解。 受到损伤的部位及其周边细胞还会发生栓化以阻塞病菌的侵入[5]。 在盐和物理损伤胁迫下， 植物的细胞壁和膜系统都会做出相应的响应[6]。 因此， 作为植物细胞壁主要成分且能够反映细胞壁以及膜系统的完整性和透过性[7]的果胶， 可以作为研究胁迫下植物内部物质响应规律的重要指标。

目前， 检测果胶的常用方法有质量法、 比色法、 液相色谱法等[8-10]。 张方艳等利用质量法对猕猴桃所含果胶进行了测定。 实验中， 将氯化钡(BaCl2)溶液和氯化钙(CaCl2)溶液作为沉淀试剂加入到各自的目标汁液中。 结果表明， 通过前者提取的果胶含量比后者提取的高将近1个百分点， 而且准确性更高[8]。 陶阿丽等采用比色法对豆腐柴叶内的果胶含量进行了研究。 实验过程中， 对浓硫酸用量、 水解温度、 咔唑无水乙醇溶液等测定条件进行了优化。 此方法的相对标准偏差(RSD)为1.529%[9]。 吴玉萍等基于液相色谱法分析了烟草中果胶的含量。 方法是， 先将烟草酸化处理产生半乳糖醛酸， 然后测定半乳糖醛酸含量， 最终换算成果胶含量。 该方法的RSD优于1.4%[10]。 上述果胶含量检测方法操作繁琐、 实时性不强、 对样本损耗较大， 并且难以实现大面积作物果胶含量连续监测。 亟需一种操作简便、 速度快、 无损的检测方法。 高光谱技术以其检测速度快、 无损、 可重复操作等优点， 广泛应用于作物生理信息的无损检测[11-12]。 本工作旨在通过高光谱技术， 建立一种盐与物理损伤胁迫下小麦果胶含量反演的新方法， 从而实现果胶含量的高精度、 快速、 无损检测。

1 实验部分

1.1 实验环境及设置

实验于吉林大学生物与农业工程学院日光温室内进行。 温室配有完善的通风、 补光、 控温、 加湿等装置， 能够有效调节小麦生长所需的环境。

将烟农0428小麦作为研究对象。 先将小麦种子置于25 ℃恒温培养箱中催芽， 一周后选取长势一致的幼苗移栽到定时增氧型水培箱中。 培养液选用霍格兰(Hoagland’s)标准营养液， 水培箱内保持每日增氧时长8 h以上。 用TDS&EC测试仪监测营养液浓度及pH值， 并对水培环境及时做出调整。

1.2 胁迫实验设计

通过向培养液中施加氯化钠(NaCl)溶液和对小麦第一片叶主脉两侧针刺分别模拟盐胁迫和昆虫叮咬造成的物理损伤。 盐胁迫和物理损伤胁迫程度分别由NaCl溶液的浓度以及针刺孔数控制。 共选取120株小麦， 分别按单因素胁迫和复合胁迫分组， 并设置了对照组(CK)。 施加胁迫水平及分组如表1所示。

1.3 信息采集与处理

使用美国Analytical Spectral Devices公司的HH2型地物光谱仪对小麦叶片样本进行测量， 并采集高光谱数据。 测量点分别位于每株小麦叶片样本的上、 中、 下部， 每点重复测量10次取平均值。 将叶片样本采集并充分匀浆， 加入提取液混合后置于90 ℃恒温水浴锅中浸提30 min。 取出后冷却， 于5 000 r、 25 ℃离心10 min， 除上清液。 重复离心后加入1 mL提取液， 置于90 ℃恒温水浴锅中水解1 h。 取出冷却后， 于8 000 r、 25 ℃离心15 min， 取上清液。 分光光度计调至530 nm， 用蒸馏水调零。 最后， 使用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定果胶含量。 小麦叶片果胶及高光谱数据的处理利用Origin2018， SPSS.26， Matlab R2018a， ViewSpecPro， AvaSoft7.2， TQ Analyst等软件。

表1 盐及物理损伤胁迫实验设计

2 结果与讨论

2.1 不同胁迫条件下小麦叶片果胶含量和高光谱特征

2.1.1 叶片果胶含量

依据设计的方案进行了为期一周的胁迫实验， 单因素和复合因素胁迫下小麦叶片果胶含量的变化情况如图1所示。 其中， A1S1和A1S2组果胶含量均呈现出先下降后上升的趋势。 胁迫初期， 由于细胞基质多糖间相互作用增强， 机体通过增加纤维素含量而降低果胶含量来抵御逆境伤害[13]， 小麦叶片细胞壁中层和初生壁中果胶含量均下降。 随后， 含有抗逆基因的调控蛋白和扩展蛋白发挥作用， 通过增加果胶含量来加强细胞间的结合。 在A3S1和A3S2组中， 叶片细胞形态遭到严重破坏， 果胶甲酯酶活性降低， 细胞壁严重甲酯化， 离子进入细胞内使大量细胞死亡[14]， 最终导致果胶含量迅速下降。 图2为不同胁迫因素对应的小麦果胶含量七天的平均值。 从图中可以看出， 经过胁迫处理组小麦叶片的果胶含量均值明显低于对照组， 而且果胶含量均值与胁迫程度呈负相关。 此外， 经差异性分析后可知， A1， A3， S2， A2S1， A2S2， A3S1， A3S2与CK差异显著(p<0.05)。

图1 一周内不同胁迫因素下小麦叶片果胶含量变化

图2 不同胁迫因素对应的小麦叶片果胶含量七天的平均值

2.1.2 高光谱特征

利用光谱仪获取了不同胁迫条件下， 325～1 075 nm波段范围内小麦叶片的高光谱特征。 光谱始末两端冗余噪声较多、 光谱信息波动较大， 而500～800 nm波段内噪声低、 光谱信息稳定， 且在750～800 nm波段形成反射平台， 故选取500～800 nm波段作为研究对象。 在500～800 nm波段内， 单因素和复合因素胁迫条件下小麦叶片反射光谱如图3(a)和(b)所示。 从图中可以看出， 不同胁迫条件下， 波峰(550 nm)和反射平台(750～800 nm)处的光谱特征(反射率)均呈现出明显差异, 并表现出一定的规律。 其中， 在单因素胁迫条件下， 550 nm波峰处， A1组和S1组表现出较高的反射率水平， A2组、 S2组与CK组的反射率水平居中， A3组的反射率最低。 在复合胁迫条件下， 750～800 nm反射平台内， 当物理损伤处于S1水平时， 反射率表现出的变化为A1S1>A2S1>A3S1。 当物理损伤处于S2水平时， 反射率的变化为A1S2>A2S2>A3S2。 即物理损伤水平一定时， 反射率与盐胁迫程度呈负相关。 因此， 高光谱曲线特征可以在一定程度上反映小麦受胁迫程度， 但难以表征果胶含量的变化规律， 因此需要建立高光谱特征与果胶含量之间的联系。

图3 不同胁迫因素下小麦叶片的高光谱特征

2.2 基于高光谱技术的果胶含量预测

2.2.1 特征波段提取

利用相关系数法对不同胁迫条件下测得的高光谱数据与小麦叶片果胶含量进行相关性分析， 二者的相关系数随波长的变化关系如图4(a)所示。 从图中可知， 光谱数据在特定波段与果胶含量具有较好的相关性。 选取相关系数大于0.32的部分， 即702～728 nm波段为原始光谱特征波段， 记为W702～728。 与此同时， 对一阶导数光谱与叶片果胶含量进行了相关性分析， 如图4(b)所示。 选取相关系数大于0.45的部分， 即690～700 nm波段为一阶导数光谱的特征波段， 记为W690～700。

图4 相关系数法提取特征波长

2.2.2 果胶含量预测模型

共采集小麦叶片样本145个， 剔除25个异常样本后按1∶3合理划分， 分别为训练集样本90个， 验证集样本30个。 以光谱敏感波段作为模型输入量， 选取主成分回归(PCR)、 偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元线性回归(SMLR)三种建模方法， 并将其与多元散射校正(MSC)、 标准正态变换(SNV)、 一阶导数(FD)、 卷积平滑(S-G)、 Norris导数滤波(NDF)[15]等五种预处理技术相结合， 共建立27种预测模型， 如表2所示。

表2 不同建模方法及预处理技术得到的预测模型

表2中，Rc和Rp分别为评价模型质量的训练集相关系数和验证集相关系数。 对比各模型的参数可知， 基于PLS+SNV+FD+NDF方法所建的模型为最优模型，Rc和Rp值分别达到了0.978 2和0.981 4。

2.2.3 最优模型性能分析

图5(a)为不同胁迫条件下， 最优模型的果胶预测含量与试剂盒测得的果胶含量之间的关系。 果胶含量的预测值与实测值一致性较高(拟合系数R2=0.997 6)， 均方根误差(RMSE)为0.35， 表明所建模型具有良好的线性预测性能。 为了评估上述最优模型的精密度， 对A1S2胁迫条件下、 同一小麦叶片样本进行了多次高光谱测量。 图5(b)为20次测量的模型预测结果。 从图中可以看出， 预测结果重复性较好， RSD为1.2%(预测均值VM=9.56 μmol·g-1)， 说明该模型具有较高的精度。

图5 (a) 最优模型的果胶预测含量与试剂盒测得的果胶含量之间的关系; (b) 果胶预测模型的精密度评估

3 结 论

建立了基于高光谱技术的小麦盐及物理损伤胁迫下果胶反演模型。 分析了单因素和复合因素胁迫下小麦叶片果胶含量以及对应高光谱特征的变化规律。 针对果胶和高光谱数据， 首先采用相关系数法筛选特征波段， 然后分别将PCR， PLS和SMLR三种建模方法与MSC， SNV， FD， S-G和NDF五种预处理技术相结合， 最后得出基于PLS+SNV+FD+NDF方法所建的模型为最优模型。 该最优模型的Rc和Rp值分别达到0.978 2和0.981 4。 不同胁迫条件下的模型预测实验可知， 果胶含量的预测值与实测值一致性较高(拟合系数R2=0.997 6)， 均方根误差(RMSE)为0.35， 表明所建模型具有良好的线性预测性能。 模型精密度实验可得， 预测结果重复性较好， RSD为1.2%(预测均值VM=9.56 μmol·g-1)， 说明该模型具有较高的精度。 与质量法、 比色法、 液相色谱法等传统果胶检测方法相比， 基于高光谱技术的反演模型方法实现了盐及物理损伤胁迫下果胶的高精度、 快速、 无损检测， 可用于作物响应逆境胁迫机理的研究， 并为大田作物胁迫预警及种植环境的精准管控提供科学参考。