李 俊，陈蓓蓓，谢婷婷，何 伟，龚会琴，廖朝选▲

(1贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550002；2贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014)

农药在农业生产中具有重要的作用，可控制病虫害的发生并减少损失，保证农产品品质与产量，其对人类经济社会发展意义重大。但由于农药在农业生产中的长期使用，对生态环境的安全和人类健康产生严重威胁。唑虫酰胺(Tolfnpyrad)是原日本三菱化学公司开发的新型吡唑杂环类杀虫杀螨剂[1]，毒性中等，具有触杀作用，并兼具杀卵、抑食、抑制产卵作用，杀虫谱广，对鳞翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、缨翅目害虫及螨类均有效，尤其是对鳞翅目小菜蛾、缨翅目蓟马等害虫有特效[2-4]。由于该药具有较好的速效性，持效期长，在蔬菜生产中被广泛使用。但是唑虫酰胺的多次、超剂量使用，会随地下水或土壤径流等进入河流、湖泊等水体，对水生态系统构成威胁。

斑马鱼作为典型的水生试验动物模型，其基因与人类具有80%以上的高度同源性[5]。大型溞是一种常见的水生生物，主要以藻类为食，是鱼类和无脊椎动物的饵料，是水生态系统中能量流动和物质循环的重要环节[6]。羊角月牙藻是众多藻类中常见的一种，是水生态系统的初级生产者，藻类是水生食物链的基础，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能[7]。斑马鱼、大型溞和羊角月牙藻分别位于水生态系统中不同营养级，具有易获取、成本低廉、个体小、繁殖快且对毒物敏感的特点，常被用于农药和化学品等环境污染物的的毒性测试，用以评价水生态系统的暴露风险[8]。

有研究报道，15%唑虫酰胺悬浮剂在田间推荐用药量下对七星瓢虫和螟黄赤眼蜂有致死或毒性效应，在农田内施用对非靶标节肢动物的危害商值HQin>5，风险不可接受[9]。由此可知，唑虫酰胺对环境生物有害，对生态系统具有一定威胁。目前，对于水生态系统中鱼类、溞类和藻类的毒性研究较少，缺少相关数据开展风险评估。本研究以斑马鱼、大型溞、羊角月牙藻为试验生物，分别探究了30%唑虫酰胺悬浮剂对三种水生生物的毒性效应，结合农药行业标准进行等级划分，为30%唑虫酰胺悬浮剂安全使用和风险评价提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

溶解氧测试仪：美国哈希公司，HQ-25d；智能人工气候培养箱：上海比郎仪器制造有限公司，PRX-250B；照度计：柯尼卡美能达(中国)投资有限公司，T-10A；藻类智能鉴定计数仪，杭州迅数科技有限公司，E100。

1.2 试验生物

斑马鱼：购自于上海宏业观赏鱼养殖场，2～3月龄，体长19～23 mm，体重0.13～0.19 g。试验开始前在温度为21～25 ℃、pH为6.0～8.5、溶解氧>80% ASV(空气饱和值)的条件下驯养7天。

大型溞：购自于武汉可乐多生物科技有限公司，由本实验室自行繁殖，以纯种小球藻喂养，于温度20 ℃±2 ℃、光暗比为16∶8、光照强度1000～1500 lux条件下培养，选取溞龄小于24 h的非头胎溞进行试验。

羊角月牙藻：购自于中国科学院淡水藻种库，由本实验室培养，于温度为21～24 ℃、光照强度为4440～8880 Lux的条件下培养，选择处于对数生长期、生长良好的藻类进行试验。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼类急性毒性试验

本试验参照《化学农药环境安全性评价试验准则》第12部分：鱼类急性毒性试验[10]的规定进行，采用静态法进行试验，每个浓度组放入10尾斑马鱼，试验液体积为3 L，每个浓度组设1个平行对照组，同时设空白对照组，试验周期为96 h。每24 h观察并记录一次供试鱼的中毒症状和统计鱼的死亡率；每24 h测定一次试验液的温度、溶解氧含量、pH值。

1.3.2 溞类急性活动抑制试验

本试验参照《化学农药环境安全性评价试验准则》第13部分：溞类急性活动抑制试验[11]的规定进行，采用静态法进行试验，每个浓度组放入5只溞龄小于24 h的非头胎溞，试验液体积为50 mL，每个处理组同时设置4个平行对照组，同时设空白对照组，试验周期为48 h。试验开始后，每24 h观察并记录一次大型溞的中毒症状和统计分析溞的抑制率；分别于0 h和48 h记录试验溶液的温度、溶解氧含量、pH值。

1.3.3 藻类生长抑制试验

本试验参照《化学农药环境安全性评价试验准则》第14部分：藻类生长抑制试验[12]的规定进行，用处于对数生长期的藻溶液配制试验液，采用静态法进行试验，每个浓度组的试验液体积为100 mL，同时设置3个平行对照组和1个空白对照组，试验周期为72 h。试验开始后，每24 h观察每个浓度组中藻的生长情况，并统计分析藻的生长抑制率；分别于0 h和72 h记录试验溶液的pH值和光照强度。

1.4 数据处理

根据试验统计的毒性测试结果，使用Excel进行数据汇总，采用SPSS 19.0软件中的Probit(概率单位法)对数据进行回归分析，然后分别计算30%唑虫酰胺悬浮剂对斑马鱼的96 h半数致死浓度LC50、大型溞的48 h半数抑制效应浓度EC50、羊角月牙藻的72 h半数抑制效应浓度ErC50、EyC50、95%置信区间及回归方程。

1.5 毒性等级划分标准

根据《化学农药环境安全评价试验准则》进行毒性等级划分，毒性等级划分标准见表1。

表1 毒性等级划分标准Tab.1 Toxicity classification standard

2 结果与分析

2.1 参比物试验

为了评估受试生物对毒性的敏感性是否符合试验要求，试验前用重铬酸钾对斑马鱼、大型溞、羊角月牙藻进行参比试验。结果表明：重铬酸钾对斑马鱼的24 h-LC50为223 mg/L，95%置信限为202～243 mg/L，重铬酸钾对斑马鱼的24 h-LC50在200～400 mg/L范围内，符合质量控制要求；重铬酸钾对大型溞的24 h-EC50为1.08 mg/L，95%置信限为0.97～1.21 mg/L，重铬酸钾对大型溞的24 h-LC50在0.6～2.1 mg/L范围内，符合质量控制要求；重铬酸钾对羊角月牙藻的72 h-ErC50为1.1 mg/L，95%置信限为0.7～1.6 mg/L，符合质量控制要求。

2.2 毒性效应

在30%唑虫酰胺悬浮剂暴露下，斑马鱼出现抽搐、异常快速游动、正面或侧面平躺、死亡等中毒症状。由表2可知，在3.00～15.00 μg a.i./L的5个等比试验浓度中，斑马鱼发生了不同程度的死亡，在96 h试验周期内累计死亡率分别为10%、40%、60%、90%、100%，其死亡率与试验浓度呈正相关关系。

表2 鱼类急性毒性试验中斑马鱼的死亡率统计结果Tab.2 Mortality statistics of Barchydanio rerio in the acute toxicity test

在0.30～3.40 μg a.i./L的30%唑虫酰胺悬浮剂影响下，大型溞发生游动缓慢、体色改变、死亡等中毒抑制症状，随时间的推移，抑制效应愈加明显。从表3可知，在0.30 μg a.i./L、0.50 μg a.i./L、0.80 μg a.i./L、1.30 μg a.i./L、2.10 μg a.i./L、3.40 μg a.i./L浓度暴露的试验溞，24 h的抑制率分别为0、10%、20%、25%、40%、70%，48 h的抑制率分别为5%、15%、25%、30%、65%、90%。

表3 溞类急性活动抑制试验中大型溞的抑制率统计结果Tab.3 Inhibition rate of Daphnia magna in the acute activity inhibition test

羊角月牙藻暴露于0.030～7.20 μg a.i./L的30%唑虫酰胺悬浮剂试验液中，藻细胞会发生变形、变小、粘连式聚集的中毒症状，唑虫酰胺对羊角月牙藻的藻细胞生长和生物量均有抑制作用。从表4可知，在72 h的暴露时间里，0.030 mg a.i./L、0.068 mg a.i./L、0.17 mg a.i./L、0.47 mg a.i./L、1.10 mg a.i./L、2.80 mg a.i./L和7.20 mg a.i./L浓度的30%唑虫酰胺悬浮剂试验液中，藻类生长抑制率分别为0.3%、8.5%、14.7%、16.5%、22.5%、63.7%和82.8%，而生物量增长的抑制率为1.7%、35.6%、53.5%、57.2%、66.9%、91.4%、97.2%。羊角月牙藻的生物量指标相对藻类生长指标对唑虫酰胺更为敏感。

表4 藻类生长抑制试验中羊角月牙藻的抑制率统计结果Tab.4 Inhibition rate of Pseudokirchneriella subcapitata in the growth inhibition test

2.3 50%致死/效应浓度与毒性等级

将试验测试浓度与试验生物死亡率或抑制率进行相关性分析，并用“1.4数据处理”相关方法进行统计分析。由表5知，30%唑虫酰胺悬浮剂对斑马鱼96 h的急性毒性LC50为0.0055 mg a.i./L，95%置信限为0.0048～0.0063 mg a.i./L；对大型溞48 h急性活动抑制效应EC50为0.0015 mg a.i./L，95%置信限为0.0011～0.0021 mg a.i./L；对羊角月牙藻72 h的藻细胞生长抑制效应ErC50=1.88 mg a.i./L，95%置信限为0.99～4.94 mg a.i./L；对藻生物量增长72 h的抑制效应EyC50为0.26 mg a.i./L，95%置信限为0.11～0.54 mg a.i./L。根据《化学农药环境安全评价试验导则》相关规定及划分标准，30%唑虫酰胺悬浮剂对斑马鱼、大型溞、羊角月牙藻的毒性等级分别为剧毒、剧毒、高毒。

表5 供试物30%唑虫酰胺悬浮剂对3种水生生物的毒性结果分析Tab.5 Analysis of toxicity of 30% tolfenpyrad suspending agent on the three aquatic organisms

3 结论与讨论

鱼类、溞类和藻类作为水生脊椎动物、无脊椎动物和初级生产者的代表，其中对毒物敏感的物种常被用于水生毒理试验。研究采用的试验生物对重铬酸钾的敏感性测试结果分别为斑马鱼(24 h-LC50=223 mg a.i./L)、大型溞(24 h-EC50=1.08 mg a.i./L)和羊角月牙藻(72 h-ErC50为1.1 mg a.i./L)，表明研究使用生物对毒物敏感，符合试材规定。

研究结果显示，30%唑虫酰胺悬浮剂对斑马鱼、大型溞和羊角月牙藻会造成不同程度的抑制效应或致死效应，等级分别为剧毒、剧毒、高毒。表明唑虫酰胺对水生生物具有很高的毒性，使用唑虫酰胺产品后，不能直接在河流、湖泊等水体进行包装清洗，或剩余药液直接倾倒入水。同时，在生态渔业生产的稻-鱼、稻-虾等环境中，不能使用唑虫酰胺产品，以防造成渔业毒害。据中国农药信息网报道，唑虫酰胺相关产品主要登记于茶树、甘蓝、柑橘树、茄子、豇豆的害虫防治，其不直接作用于水体，严格按规定用药可能对水生态系统风险有限，但具体风险情况还需结合产品的性质和行为开展风险评估。