吴昌安 曹岐新

阿尔茨海默病（alzheime’s disease，AD）是一种严重的神经系统退行性疾病，临床表现以认知能力下降和行为功能障碍为主要特征，是十分常见的痴呆类型［1］。AD的防治已成为医学研究的热点之一［2］。目前研究表明［3-5］，石菖蒲具有抗心脑血管硬化与栓塞、抗肿瘤、抗炎、调节免疫等作用；在神经退行性疾病的防治中也有重要作用。大数据网络分析预测，石菖蒲活性物质中存在79个化合物可能与AD有着密切关系［6］。已有研究证实石菖蒲挥发油及其水提液可阻止Aβ25-35由α-螺旋向β-折叠转变，以抑制β淀粉样蛋白的沉聚，减轻其神经毒性；石菖蒲中β-细辛醚可下调AD大鼠中GAP-43、PSD-95表达水平，上调SYP的表达，从而增加大鼠海马中CA1区突触数目，进而改善大鼠认知功能［7］。本研究探讨石菖蒲调控小胶质细胞极化减轻AD小鼠神经炎症反应并改善认知功能障碍的作用及机制，为开发针对AD的新型药物提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 WT小鼠：SPF级C57BL/6J小鼠（雄性），6~8个月龄，体重30~35 g，AD转基因小鼠：SPF级APP/PS1小鼠（雄性），6~8个月龄，体重30~35 g。购于上海南方模式生物科技股份有限公司（合格证号：312024300000732）。

1.2 主要试剂 石菖蒲饮片（三九药业），ELISA试剂盒（Abnova，KA1158），高尔基试剂盒（hitobiotec，HTKNS1125），BACE1抗 体（proteintech，12807-1-AP），Aβ抗体（proteintech，25524-1-AP）；ADAM10抗体（proteintech，25900-1-AP）；PS1抗体（proteintech，16163-1-AP）；GAPDH抗 体（proteintech，60004-1-Ig）。

1.3 实验方法 （1）石菖蒲提取物纯化：取100 g石菖蒲饮片粉碎后置于圆底烧瓶并加入1,000 mL超纯水，加热沸腾后转温火继续熬制1 h，取第1遍水提液；再加入400 mL超纯水继续第2次熬制，后将2次所收集的水提液混合后离心2次（3,000 r/min，5 min），取上清液，蒸发浓缩至100 mL，使得药物浓度为1 g/mL。（2）动物模型与分组：实验分为4组，0.9%氯化钠溶液灌胃的野生型小鼠（WT+NS组），石菖蒲提取物灌胃的野生型小鼠（WT+AT组），0.9%氯化钠溶液灌胃的AD转基因小鼠（AD+NS组），石菖蒲提取物灌胃的AD转基因小鼠（AD+AT组）。每次灌胃石菖蒲提取物10 g/kg，对照组灌胃相同体积的0.9%氯化钠溶液。（3）水迷宫：① 训练期：小鼠头朝池壁放入水迷宫中。记录动物游泳路径及寻找平台所用时间，并让小鼠停留在平台10 s，连续5 d，每天每只小鼠训练4次。②测试期：第6天，将平台拆除，将小鼠从原先平台的对侧象限放入水中。记录60 s，观察小鼠进入原平台象限所花时间和穿越该象限的次数。（4）免疫印迹：小鼠脱颈处死后取海马，放入离心管中加入蛋白裂解液，在冰上给予组织破碎后静置30 min，4℃下12,000 r/min离心25 min，最后取上清液作为初样品。采用BCA法测定浓度后制样。经过PAGE凝胶电泳（80 V）分离蛋白，接着将蛋白通过电转转移至PVDF膜，脱脂牛奶在室温下封闭至少2 h。孵上按说明书以特定比例稀释一抗，4℃环境下孵育过夜。次日给予PBS清洗后在室温下二抗孵育2 h并清洗。于暗房内滴加ECL液显色。所有结果以GADPH为内参校正后再进行比较。（5）高尔基染色：按Kit说明书进行，溶液1和2须提前1 d混合备用，次日只取上清液。小鼠麻醉处死后取脑，PBS洗去血迹与脑膜后，转入混合液后避光下室温处理2周。接着将脑组织转移致溶液3，再次避光处理2~7 d。裹上OCT，在干冰冻结后直接在冷冻切片机上切片，厚度100μm，转移至玻片上避光24 h。溶液4和5，各5 mL，再添加15 mL水，混均后，把片子放进混合液15 min，依次在50%、75%、95%、100%酒精溶液中梯度脱水，最后二甲苯透明，中性树脂封片。在共聚焦显微镜下观察。（6）ELISA：先将ELISA板以特定抗体所包被，然后以封闭液进行封闭，按重复孔位依次加入稀释后样品和标准品，摇床上孵育1 h，加入显色液显色，立即在酶标仪上检测450 nm处样品与标准品的OD值。以标准品的浓度绘制标准曲线，并根据标准曲线计算目标蛋白浓度。（7）qRT-PCR：应用Trizol法提取小鼠海马总RNA，将其逆转录成cDNA，引物稀释至10μmol/L，按照以下比例进行配置：2×SYBR Green Master 5μL + Forward primer（10μmol/L）0.3μL + Reverse primer（10μmol/L）0.3μL + cDNA Template 10 ng，给予Nuclease-free 水加至总体积为10 μL，并给予混合。将板置于qRTPCR仪上测量，最后数据用2-ΔΔCт方法进行分析。（8）小胶质细胞分离及流式细胞分选：小鼠灌注后取下海马组织置于流式细胞术缓冲液，剥离脑膜后转移至15 mL Tenbroeck homogenizer中，震荡以破碎组织。以70μm细胞过滤柱过滤2次，收集单细胞悬液。离心后以流式细胞仪缓冲液重悬后转移至流式细胞仪管中。把细胞标记上带有抗CD11b、CD45等小胶质标记物，4℃避光孵育30 min。以含1%PFA PBS溶液重悬细胞。在流式细胞仪检测：选择活细胞后依据脉冲宽度和面积比选择线性分布细胞，消除碎屑。依据不同标记获得细胞计数。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析、多因素重复测量方差分析，两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠水迷宫寻找平台的时间 与WT+NS组比较，AD+NS组中小鼠寻找平台的时间延长，差异有统计学意义（P＜0.001）。AD+AT组小鼠从训练第2天开始，寻找平台的时间逐渐缩短，直至训练后第5天，与AD+NS组差异有统计学意义（P＜0.05），但时间仍长于WT+NS组，见表1。

表1 各组小鼠在水迷宫中寻找平台的时间（s）

2.2 石菖蒲提取物处理后，AD小鼠海马中突触的数目有所恢复 与WT+NS组比较，AD+NS组小鼠突触数目下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。AD+AT组小鼠突触数目比AD+NS组有所恢复，差异有统计学意义（P＜0.05）。但突触数目仍少于WT+NS组，见表2。

表2 石菖蒲提取物处理后各组小鼠的突触数目比较（±s）

表2 石菖蒲提取物处理后各组小鼠的突触数目比较（±s）

注：与WT+NS组比较，*P＜0.05；与AD+NS组比较，#P＜0.05

组别 n 突触数目WT+NS 3 11.75±1.71 WT+AT 3 11.25±1.71 AD+NS 3 4.75±0.96*AD+AT 3 8.75±1.71*#F值 16.931 P值 ＜0.001

2.3 各组小鼠海马中Aβ、BACE1、PS1、ADAM10表达水平比较 与WT+NS组比较，AD+NS组海马中总Aβ的表达水平上升，差异有统计学（P＜0.05）。AD+AT组小鼠Aβ的表达水平比AD+NS组小鼠下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。但仍高于WT+NS小鼠，见表3。各组小鼠BACE1、PS1、ADAM10表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表3 各组小鼠的Soluble/insoluble Aβ表达水平比较（±s）

表3 各组小鼠的Soluble/insoluble Aβ表达水平比较（±s）

注：与WT+NS组比较，*P＜0.05；与AD+NS组比较，# P＜0.05

组别 n Soluble insoluble WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.19 WT+AT 3 0.96±0.17 0.99±0.22 AD+NS 3 2.40±0.26* 3.47±0.21*AD+AT 3 1.73±0.15*# 2.00±0.36*#F值 24.389 63.624 P值 ＜0.001 ＜0.001

表4 各组小鼠BACE1、PS1和ADAM10蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组小鼠BACE1、PS1和ADAM10蛋白表达水平比较（±s）

组别 n BACE1 PS1 ADAM10 WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.20 1.00±0.20 WT+AT 3 0.99±0.22 1.02±0.27 1.03±0.21 AD+NS 3 1.07±0.15 1.09±0.21 1.00±0.26 AD+AT 3 1.06±0.29 0.97±0.25 1.13±0.46 F值 0.075 0.156 0.126 P值 0.972 0.923 0.942

2.4 各组小鼠海马中IL-8、IL-10、IL-1β与TNF-α的表达水平比较 与WT+NS组比较，AD+NS组小鼠海马中IL-1β、TNF-α表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。AD+AT组与AD+NS组比较，IL-1β、TNF-α表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05），但仍高于WT+NS组。与WT+NS组比较，AD+NS组小鼠海马中IL-8、IL-10表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。AD+AT组比AD+NS组小鼠IL-8、IL-10表达更高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 各组小鼠海马中IL-8，IL-10，IL-1β与TNF-α的表达水平的比较（±s）

表5 各组小鼠海马中IL-8，IL-10，IL-1β与TNF-α的表达水平的比较（±s）

注：与WT+NS组比较，*P＜0.05；与AD+NS组比较，#P＜0.05

组别 n IL-1β TNF-α IL-8 IL-10 WT+NS 3 1.00±0.33 1.00±0.20 1.00±0.36 1.00±0.21 WT+AT 3 1.02±0.23 1.05±0.27 0.97±0.25 1.01±0.08 AD+NS 3 12,830.33±1,980.32* 12,943.33±1,501.54* 4,333.33±4,163.33* 4,333.33±3,511.88*AD+AT 3 728.67±473.26*# 966.67±404.15*# 93,000.00±28,053.52*# 81,666.67±23,629.08*#F值 114.98 198.64 31.33 31.92 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 各组小鼠海马中小胶质细胞向M2极化的比例比较 与AD+AT组比较，AD+NS组小鼠海马中的M1表型的小胶质细胞比例上调，差异统计学意义（P＜0.05）。与AD+NS组比较，AD+AT组小鼠海马中M2表型小胶质细胞比例上调，差异统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前AD发生与发展的机制仍不明确，众多研究假说中Aβ错误折叠并在神经细胞外沉积形成淀粉样斑块获得多数学者认可［8-9］。Aβ是由β淀粉样前体蛋白（APP）在三种不同的水解酶——α-分泌酶（ADAM10）、β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶（PS1）水解后产生，在大脑皮层与海马中聚集、沉积并最终形成具有神经毒性的Aβ淀粉样斑块，导致神经的退行性改变［2］。

研究证实炎症反应是AD的重要病理生理基础，神经系统中的炎症细胞——小胶质细胞［10］，其功能异常与AD发生发展密切相关［11-12］。目前研究认为，小胶质细胞被激活后可向不同的亚型极化，分别是加重神经炎症反应的M1型细胞，分泌促炎性介质TNF-α、IL-1β等加重神经损伤，还有抗神经炎症反应的M2型小胶质细胞，分泌IL-8、IL-10等抗炎性因子等保护神经并促进损伤后修复等［13-14］。研究发现AD病理生理过程中小胶质细胞可异常增殖并活化后向Aβ淀粉样斑块聚集，在这一过程中小胶质细胞向M1和（或）M2极化：M1型释放促炎因子诱导神经炎性损伤，而M2型吞噬Aβ斑块，分泌抗炎因子促进组织修复［15］。因此，调控小胶质细胞M1与M2极化可能是延缓AD进程的潜在靶点。

石菖蒲有诸多药用价值，如抗心脑血管硬化与栓塞、抗肿瘤、抗炎、调节免疫等［7］。有研究认为石菖蒲中的β-细辛醚、丁香酚可促进AD小鼠学习记忆，降低AD小鼠脑中的Aβ淀粉样斑块，上调LRP-1及LRP-2水平。也有研究认为，石菖蒲挥发油可下调AD大鼠中GAP-43、PSD-95的表达水平和线粒体膜电位，促进SYP表达，增加海马神经突触数量，进而改善AD大鼠认知功能障碍［16］。本研究显示，石菖蒲提取物处理后AD小鼠水迷宫寻找平台时间减少，证实石菖蒲提取物可改善AD小鼠的认知记忆能力。为了进一步研究发现，石菖蒲提取物处理后AD小鼠海马中突触的数目有所恢复，这可能是石菖蒲提取物改善AD小鼠认知、记忆能力的组织学基础。由于Aβ淀粉样斑块的沉积是AD的病理基础之一，采用ELISA检测小鼠海马中Aβ的表达水平，证实石菖蒲提取物可下调AD小鼠海马中Aβ水平；同时，针对APP的三种水解酶进行检测，发现BACE1、PS1、ADAM10表达水平并未发生改变，这证实Aβ水平的改变与水解酶无关，需要对Aβ的清除过程进一步探索。由于Aβ所致神经炎症反应在AD病程中至关重要。因此，以qRT-PCR检测小鼠海马中炎症因子的表达水平，结果发现石菖蒲提取物处理后AD小鼠海马中IL-1β、TNF-α表达下调，而IL-8、IL-10表达上调，这表明石菖蒲提取物可抑制AD所产生的炎症反应。IL-1β、TNF-α与IL-8、IL-10分别是M1与M2两种小胶质细胞亚型所分泌的代表性炎症因子，以流式细胞学检测小鼠海马中小胶质细胞极化水平发现，石菖蒲提取物处理后AD小鼠海马中小胶质细胞向M2极化的比例提高，这也与石菖蒲提取物处理后炎症因子的改变相吻合。

综上所述，石菖蒲提取物可通过调控小胶质细胞向M2极化从而减轻AD小鼠神经炎症反应并改善AD小鼠的认知记忆功能障碍，为石菖蒲提取物临床应用于治疗AD提供一种实验依据。