南江黄羊体表脓肿病原菌的分离鉴定与药敏试验
2022-09-02谭玉祥何兴隆
谭玉祥，何兴隆，魏 甬
（1.巴中市南江黄羊科学研究所，四川 南江 635600；2.四川省南江县动物疫病预防控制中心，四川 南江 635600；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）
体表脓肿病是南江黄羊养殖生产中的常见病，以躯干体表出现局部脓肿病灶为特征，季节性不明显，各个日龄阶段均可发生，引起局灶性红肿热痛、个体生长迟滞等。通常在脓肿出现波动感后，采取外科手术式切口、排脓、冲洗、消毒、抗菌药物灌注，能获得一定的疗效。若治疗不当或治疗不及时，病灶可逐渐扩大、化脓甚至出现全身败血症，从而给南江黄羊防疫管理、产品安全等方面带来较大的损失。本文就该病致病菌的分离鉴定及抗菌药物筛选开展探讨。
1 材料与方法
1.1 病料 从南江县部分规模羊场患病羊的颈部、胸部、腹部及后躯部等体表脓肿病灶处经局部剪毛、碘酒消毒及酒精脱碘消毒后，用灭菌注射器具穿刺无菌采集脓液样品。
1.2 主要试剂 绵羊血琼脂平板，MH 琼脂培养基，普通肉汤培养基，药敏纸片，细菌DNA提取试剂盒，革兰氏染色试剂盒。
1.3 方法
1.3.1 细菌分离及形态观察 用无菌接种环采取病羊脓液样品，无菌条件下划线接种于绵羊血琼脂平板，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，再对单菌落进行纯化培养。参照革兰氏染色试剂盒说明书对细菌进行染色，在光学显微镜下观察结果。
1.3.2 细菌16S rDNA 鉴定 将纯化培养的细菌无菌接种至普通营养肉汤培养基中，于37 ℃恒温培养箱中振荡培养18 h，用DNA提取试剂盒提取细菌DNA。采用细菌通用16S rDNA基因引物进行PCR扩增，引物设计及PCR扩增条件参照张玲等［1］的试验报告。PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在GenBank数据库中比对，根据同源性高低确定细菌种属。
1.3.3 药敏试验 参照向益等［2］的方法进行药敏试验，根据纸片法抗菌药物敏感试验标准（WST 125-1999）及美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准与指南进行结果判定。
2 结果
2.1 细菌分离及形态观察 从5 只病羊不同部位的脓肿液中共分离出4 株细菌，将其编号为①～④号，具体情况见表1。①～④号分离菌接种至血平板后，均出现透明的β溶血环。①号为革兰氏阴性菌，呈细杆状，单个散在或成对存在；②③号为革兰氏阳性菌，呈球杆状，两端钝圆，单个散在存在；④号为革兰氏阴性菌，呈球杆状。
表1 细菌培养检测结果
2.2 细菌16S rDNA 鉴定 用PCR 扩增4 株细菌的16S rDNA，测序结果经比对后发现：①号为短小芽孢杆菌；②③号均为假结核棒状杆菌；④号为支气管败血波氏杆菌。
2.3 药敏试验 ①号短小芽孢杆菌对头孢吡肟和头孢西丁有耐药性，对其余10种药物敏感或中度敏感，详见表2。②号假结核棒状杆菌对12 种药物敏感或中度敏感，详见表3。③号假结核棒状杆菌对头孢西丁和链霉素存在耐药性，对其余10 种药物敏感或中度敏感，详见表4。④号支气管败血波氏杆菌对头孢西丁耐药，对其余11种药物敏感或中度敏感，详见表5。
表2 ①号短小芽孢杆菌的药敏试验 mm
表3 ②号假结核棒状杆菌的药敏试验 mm
表4 ③号假结核棒状杆菌的药敏试验 mm
表5 ④号支气管败血波氏杆菌的药敏试验 mm
3 讨论
本研究从病羊的脓肿液病料中分离培养出4株细菌，通过形态学及16S rDNA鉴定为短小芽孢杆菌、假结核棒状杆菌、假结核棒状杆菌和支气管败血波氏杆菌，这4株细菌都具有溶血性。
短小芽孢杆菌通常作为一种有益菌应用于各个领域［3］，由于其具有溶血性，目前在人类医学上正研究用其治疗血栓。在植物方面，由于其具有抑制细菌生长的作用，目前正研究将其作为一种生物拮抗剂用于生物防治。短小芽孢杆菌还可用于传统发酵食品的生产、废水处理和环境污染物的降解。然而也有很多报道指出短小芽孢杆菌能够引起人类疾病，如抑制精子活动、破坏精子细胞膜通透性屏障、破坏线粒体以及抑制胞浆NAD 还原反应等［4］。本研究从病羊的脓肿液中分离出短小芽孢杆菌，提示该菌可能对羊具有一定的致病性，但是关于该菌对山羊的具体致病机制仍需进一步研究。
假结核棒状杆菌是一种兼性细胞内寄生菌，具有溶血性。该菌侵入宿主后，随血液传播，在淋巴间隙或组织间形成化脓性病灶。目前，有较多的关于该菌引起羊患脓肿病的报道，并且放牧羊的发病率很高，通常引起山羊体表淋巴结肿胀化脓，且能导致体内淋巴结或内脏脓肿［5］。随着抗生素的滥用，该菌的耐药性逐渐升高，所以在用药前进行药敏试验可有效缩短治疗时间，节约成本。李基棕等［6］从山羊肩前淋巴结脓肿样本中分离到一株假结核棒状杆菌，发现其对链霉素和环丙沙星耐药，这与本研究结果存在差异，可能与菌株来源不同有关。
目前，支气管败血波氏杆菌已从患病的猪［7］、小熊猫［8］、猫［9］、林麝［10］和兔［11］身上被分离出来。支气管败血波氏杆菌主要引起呼吸道疾病，引起动物鼻炎、支气管肺炎或脓疱型肺炎等。本研究从病羊的脓肿病料中分离出了一株支气管败血波氏杆菌，可见该菌也会引起动物其他组织感染。研究发现支气管败血波氏杆菌可从家畜传染给人类，并对免疫功能低下的人群可能造成严重感染，所以该菌具有一定的公共卫生学意义［12］。从不同动物身上分离的支气管败血波氏杆菌菌株存在不同程度的耐药性，但总的来说，所有支气管败血波氏杆菌分离株均对头孢类药物耐药，所以临床上应选择性地用药治疗。
4 结论
短小芽孢杆菌是否能引起山羊致病仍需进一步研究，假结核棒状杆菌和支气管败血波氏杆菌可能是引起此次南江黄羊患皮肤脓肿病的病原。此外，在养羊生产中可交叉使用克拉霉素、环丙沙星、青霉素和四环素等药物，用于治疗由短小芽孢杆菌、假结核棒状杆菌和支气管败血波氏杆菌引起的感染。
