尹美娟，刘真一

(河北中医学院，河北 石家庄 050091)

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》。具有滋补肝肾，益精明目的功效，可坚筋骨，延缓衰老，其药用价值备受历代医家的推崇。同时现代药理学研究证明：枸杞有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、降血脂、降血糖、降血压、补肾、保肝、明目、养颜、健脑、排毒、保护生殖系统、抗辐射损伤等16项功能[1]。

枸杞子是我国传统中药材，也是国家卫生部规定的药食同源的物品。由于市场需求及出口总量的不断扩大，其种植正在逐年递增[2-3]。近年来关于枸杞子的鉴定及化学成分的研究更为医家和国内外学者所瞩目。市场上流通多为道地产区宁夏的枸杞子，除宁夏外也被广泛种植于青海、甘肃、河北等中国北方省份。多种栽培品形态相似，因生长环境不同在化学成分和药理作用等方面出现些许差异。不同产地的枸杞子之所以具有药理活性差异与其成分含量有着一定联系，如： 原儿茶醛有广谱抗菌抗炎、抗氧化清除自由基等作用[4]; 儿茶素、表儿茶素具有清除自由基、抗癌、抗炎、抗突变、延缓衰老、降低胆固醇等作用[5]; 咖啡酸有抗菌抗病毒、凝血、降血脂、中枢兴奋等作用[6]。所以，酚酸类成分成为枸杞子生物活性的物质基础之一。

本研究建立HPLC法同时测定宁夏、青海、甘肃、河北四种不同产区的枸杞子中东莨菪内酯、表儿茶素、原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸、芦丁的含量，并对该方法进行方法学考察，为枸杞子药材质量提供一种高效、方便、简洁的检测方法。

1 仪器与材料

1.1 试验设备器材

高效液相色谱仪(配置泵LC-20A型，DGU-20A5R真空脱气机，LC-20AT溶液传输单元，CTO-20A柱温箱，SPD-M20A二级管阵列检测器和色谱工作站)，日本岛津公司；Bp211-D型电子天平(十万分之一)，德国Sartorous公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验材料

宁夏产枸杞和青海产枸杞都源于安国市祁溴中药饮片有限公司；甘肃瓜州产枸杞源于宁夏宁馨儿生物科技有限公司；河北产枸杞源于承德中泽源农业开发有限公司。芦丁、原儿茶酸和儿茶素购于源叶生物有限公司；咖啡酸和东莨菪内酯购于中国食品药品检定研究院；表儿茶素购于中国药品生物制品检定所；甲醇(分析纯)购于天津市永太化学试剂有限公司；乙腈购于北京科宁兴业有限公司；冰醋酸购于天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱，流动相A为乙腈-水-醋酸(5∶94.5∶0.5)，流动相B为乙腈-水-醋酸(72∶27.5∶0.5)，梯度洗脱(0～18 min，100%～90%A；18～35 min，90%～70%A；35～45 min，70%～50%A；)；流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长为280 nm，对照品及样品色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取原儿茶酸1.72 mg，儿茶素1.95 mg，咖啡酸1.08 mg，东莨菪内酯0.68 mg，表儿茶素3.36 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制成相应的贮备液。精密称取芦丁1.98 mg，置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，制成相应的贮备液。然后，精密吸取各贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，既得混合对照品溶液(每1 mL溶液中分别含有原儿茶酸0.0172 mg，儿茶素0.0195 mg，咖啡酸0.0108 mg，表儿茶素0.0336 mg，东莨菪内酯0.0068 mg，芦丁0.0079 mg)。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取干燥的宁夏枸杞、青海枸杞、甘肃枸杞和河北枸杞10.000 g，用50%甲醇超声提取15 min，料液比为(1∶20)。提取完成后，提取液过滤，并用少量的甲醇多次洗涤滤渣，合并滤液浓缩提取液，并定容于10 mL量瓶中备用。使用时，从10 mL的量瓶中精密吸取浓缩的提取液1 mL于10 mL的量瓶中，并用50%的甲醇定容，用0.45 μm的有机滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

分别吸取“2.2”项下的混合对照品溶液，依照“2.1”项下的方法分别取5、10、15、20、25、30、40、45 μL注入色谱仪，以进样量(μg)为自变量(X)，色谱峰面积为因变量(Y)，绘制标准曲线，建立回归方程。线性考察结果见表 1所示。

表1 各化学成分线性关系

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法进行实验，连续重复进样测定7次，计算峰面积RSD。结果原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、东莨菪内酯、芦丁的RSD分别为0.1788%、0.2698%、0.3176%、0.2268%、1.7916%、0.1582%，表明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验

精密称取同一枸杞样品(宁夏)，按“2.3”项下的方法平行制备6 份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定。计算东莨菪内酯、表儿茶素、原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸和芦丁的平均含量分别为0.2934、0.2715 、0.2369、0.1472、0.0597 、0.2649 mg/g，RSD 分别为1.9%、1.4%、1.7%、1.8%、1.2%、1.2%。

2.7 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下的供试品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，计算峰面积RSD。结果原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、东莨菪内酯、芦丁的RSD分别为0.95%、1.45%、2.00%、0.49%、0.39%、1.07%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已测定含量的供试品(产地宁夏)9份，每份 5 mL。然后，3份加入“2.2”项下的混合对照品溶液2 mL，3份加入混合对照品溶液3 mL，3份加入混合对照品溶液 4 mL，在“2.1“项色谱条件下测定，计算加样回收率RSD。结果见表2所示。

表2 加样回收率结果

续表2

2.9 含量测定

精密吸取“2.3”项下的各供试品溶液10 μL，依照“2.1”项下的方法进行实验，采用标准曲线法计算各产地供试品中东莨菪内酯、表儿茶素、原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸和芦丁的含量，结果见表3所示。

表3 不同产地枸杞子的含量测定结果(n=3)

3 结 论

枸杞是药食同源的特色型植物资源，具有延缓衰老、增强免疫力的功效，可强身健体，已被越来多的人所喜爱，枸杞药材质量也备受关注。枸杞在我国分布广泛，应用历史悠久，其中宁夏枸杞已经在我国宁夏地区形成大规模种植[7]，其他地区如甘肃、青海、内蒙古、新疆、河北产枸杞也在枸杞市场占有很大比例，对这些枸杞产区的枸杞药材质量进行进一步的研究有着深刻的现实意义。建立简单快捷能够反映药材质量的研究方法就成为枸杞药材质量研究的前提，本文采用的高效液相色谱法是中药材质量控制常用的方法，可以准确的测定药材的活性成分是否达标，保证药材质量。已有研究发现，用HPLC 法测定枸杞的石油醚、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇和水的不同溶剂提取物中总酚含量，并分别检测每一溶剂提取物抗氧化能力，发现抗氧化能力主要与其总酚含量相关[8]。现代药理研究证明，枸杞子生理活性广泛，其所表现出来的生物活性都与抗氧化活性相关[9]，如抗衰老[10]、保护心脏[11]、抗糖尿病[12]、保肝[13]、抗阿尔茨海默病[14]等。研究证实，由自由基引发的氧化作用是导致身体中组织器官损伤、病变的重要原因之一，人体内自由基的过度氧化会引起慢性疾病及衰老效应，适量补充抗氧化的药食两用的药材是清除人体自由基、增强抗氧化防御系统、延缓衰老、预防疾病的最佳保健方法[15]。综上，酚酸性成分在枸杞生物活性中占有重要地位，本研究建立了枸杞中6种酚酸性活性成分的含量测定方法，该方法简单便捷，回收率高，精密度、线性、稳定性均符合要求，可作为枸杞药材质量标准含量测定的方法。由实验测定结果分析可知： 所有样品中6种酚酸性成分的平均含量大体上依次为东莨菪内酯>表儿茶素>芦丁>原儿茶酸>儿茶素>咖啡酸。实验结果表明，东莨菪内酯在6种酚酸类成分中含量最高，东莨菪内酯是枸杞各部位如枸杞子、地骨皮、天精草中重要的有效成分之一[16-18]，东莨菪内酯被认为是枸杞子中抑制前列腺癌细胞PC3 增殖效果最好的活性成分[19]，有研究表明，芦丁、东莨菪内酯、阿魏酸可能是枸杞子含有的具有体外抗氧化活性的化合物，其中，芦丁是枸杞子清除DPPH自由基活性的代表物质，东莨菪内酯是枸杞子还原能力的有效物质[20]。本研究结果也进一步证实，东莨菪内酯和芦丁在各产地的枸杞中含量均比较高，说明芦丁和东莨菪内酯作为枸杞中主要的抗氧化活性化合物可能与其具有较高的含量有关。另外，东莨菪内酯在植物适应环境中具有非常重要的生态功能[21]，这可能是枸杞适于我国北方大面积区域生长的主要原因。不同产地样品中6种酚酸性成分的含量大体上依次为宁夏样品>青海样品>甘肃样品>河北样品。实验结果表明，宁夏枸杞作为道地药材6种酚酸性成分含量均比较高，这也进一步证实四个产地的枸杞药材质量宁夏产枸杞最好。