孙光军， 潘忠梅， 曹 毅， 桑维钧， 何世芳， 陆 宁， 陈兴江

(1.中国烟草总公司贵州省公司，贵州贵阳 550004； 2.贵州省烟草科学研究院，贵州贵阳 550081；3.贵州大学烟草学院，贵州贵阳 550025)

烟草是一类重要的经济作物，在我国有 100万hm的种植总面积。多主棒孢霉()属于暗色菌科棒孢属，是一种重要的植物病原菌。由多主棒孢霉引起的棒孢霉叶斑病寄主范围广泛，可侵染橡胶、烟草、黄瓜、木槿、莲藕、草莓、苎麻、茄子等530多种植物，严重威胁农作物产业的发展。棒孢霉侵染烟草叶片在世界范围内于1973年首次报道，1998年在我国贵州首次发现其侵染烟草。受侵染叶片初产生暗绿色小点，周围褪绿变黄，后发展为圆形或不规则形褐色斑点，密集的小斑最终可联合为不规则形的褐色大病斑。条件适宜时，叶背病斑上覆有褐色霉层。目前，国内烟草棒孢霉叶斑病主要分布于贵州省、广西壮族自治区等烟区，贵州大部分烟区均有发生，常与赤星病混发，高湿时流行速度比赤星病更快，局部区域危害较重。大量孢子是研究多主棒孢菌致病机制等的基础，因此研究多主棒孢霉的产孢适宜条件具有重大意义。Onesirosan等研究了棒孢霉产孢因素得出，当培养3 d后首先刮擦培养物，后在连续光照下再培养3 d，孢子大量增多。关国经等研究得出，在PDA培养基上27.5 ℃、光照和保湿培养，烟草棒孢病菌产孢较多。后关国经等于2006年得出，烤烟棒孢霉叶斑病菌产孢最适温度是25～30 ℃。裴月令等研究得出，光暗交替或连续光照适于烟草棒孢菌产孢。谭海文等的研究显示，30 ℃、碳氮源分别为乳糖和硝酸钾及完全黑暗等条件最有利于烤烟棒孢菌分生孢子形成。番华彩等研究得出，香蕉棒孢霉叶斑病病原菌在玉米粉培养基上产孢量最高。目前，对烟草棒孢霉叶斑病病原菌产孢量的研究主要集中在温度光照等，未进行一定的诱导产孢试验，导致以往的产孢方法获取孢子的量有限，已经无法满足病原菌致病机制等生物试验的需求。本研究通过对病原菌在不同培养条件下产孢量的统计，寻找产孢量最多的条件，为烟草棒孢霉叶斑病病原菌致病机制等的试验研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地点

供试菌株：烟草棒孢霉菌株YC1104，登录号为MW686731，贵州省烟草科学研究院保存。

供试培养基：马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、察氏培养基(Czapek)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

试验时间：2021年10—11月。

试验地点：贵州省烟草科学研究院。

1.2 病原菌产孢量影响因素

1.2.1 不同温度、pH值、诱孢方式对病原菌产孢量的影响 选用笔者筛选出的最适产孢的马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)和实验室常用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行病原菌不同温度、pH值和诱孢方式的产孢研究。试验设置8个温度梯度，分别为5、10、15、20、25、28、30、35 ℃。设置PSA 培养基、PDA培养基8个pH值梯度，pH值分别为 4、5、6、7、 8、9、10、11。培养基pH值用1 mol/L 的HCl溶液和1 mol/L 的NaOH溶液调节。

不同诱孢方式试验参照王静等的办法，设置为：T1，光照培养，即昼夜光照培养(全光照)；T2，暗培养，即昼夜无光培养(全黑暗)；T3，12 h光照培养与 12 h 黑暗培养交替进行(12 h光暗培养)；T4，12 h 近紫外光照射/12 h黑暗交替培养(12 h紫暗交替)；T5，将健康离体烟叶洗净，剪成2 cm×2 cm长的方块，121 ℃ 高压灭菌20 min冷却后，置于接种的菌饼表面，暗培养(烟块+全黑暗)；T6，将健康离体烟叶洗净，剪成2 cm×2 cm长的方块，121 ℃ 高压灭菌20 min冷却后，置于接种的菌饼表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培养(烟块+12 h紫暗交替)；T7，将6 mm菌饼接种于9 cm直径培养基 28 ℃ 暗培养5 d后，用无菌牙签分别划伤菌落表面3刀，继续暗培养(物理划伤3刀)；T8，将6 mm菌饼接种于9 cm直径培养基28 ℃ 暗培养5 d后，用无菌牙签分别划伤菌落表面5刀，继续暗培养(物理划伤5刀)。每处理3次重复，28 ℃ 培养。

接种9 d后拍照记录菌丝生长情况，接种11 d后，每皿用10～40 mL无菌水洗涤培养基表面且刮下所有菌丝体于 50 mL离心管中，晃动悬浮液 1 min，每皿每次取5 μL悬浮液，共取3次，在光学显微镜下镜检记录孢子数。

1.2.2 不同碳源、氮源对病原菌产孢量的影响 以Czapek培养基为基础培养基，分别以蔗糖及等量替换的山梨醇、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉、果糖、乳糖和麦芽糖为碳源；分别以硝酸钠及等量替换的牛肉浸粉、丙氨酸、氯化铵、甘氨酸、尿素、苏氨酸和蛋白胨为氮源，配制成不同碳氮源的培养基。对照为不加碳氮源的培养基，分别将6 mm菌饼置于培养基皿中央，28 ℃ 暗培养，每处理3次重复，方法同“1.2.1”节记录孢子数。

2 结果与分析

2.1 不同温度、pH值、诱孢方式对病原菌产孢量的影响

由表1、图1～图6可知，在PSA培养基上，不同温度下病原菌产孢量有显著差异。5 ℃ 时病原菌不产孢，在10～30 ℃ 温度下，病原菌产孢逐渐增多，在30 ℃ 时产孢量最多，温度达35 ℃ 时产孢量较30 ℃ 明显减少。不同pH值条件下病原菌产孢量存在差异，当pH值为7时产孢最多，其产孢量显著多于其他pH值。不同诱孢方式病原菌产孢量差异显著，T6处理(烟块+12 h紫暗交替)产孢量最多， 其次是T3处理(12 h光暗交替)、T4处理(12 h紫暗交替)，其他处理差异不大。

表1 PSA培养基上不同温度、pH值、诱孢方式对病原菌产孢量的影响

由表2、图7～图12可知，在PDA培养基上，不同温度下病原菌产孢量有显著差异，5、10 ℃时病原菌不产孢，在15、28 ℃ 温度下，病原菌产孢逐渐增多，在28 ℃时产孢量最多，温度达30 ℃ 时产孢量较28 ℃ 明显减少，30 ℃后产孢量明显减少。不同pH值条件下病原菌产孢量存在差异，当pH值为6时产孢最多，其产孢量显著多于其他pH值。不同诱孢方式病原菌产孢量差异显著，T6处理(烟块+12 h紫暗交替)、T4处理(12 h紫暗交替)产孢量显著多于其他处理。

表2 PDA培养基上不同温度、pH值、诱孢方式对病原菌产孢量的影响

2.2 不同碳源、氮源对病原菌产孢量的影响

由表3、图13～图15可知，不同碳氮源病原菌产孢量存在显著差异。当碳源为果糖时， 病原菌产孢最多，其次是蔗糖，再次为麦芽糖和乳糖，无碳源处理产孢最少。当氮源为硝酸钠时，病原菌产孢最多，其次是甘氨酸和苏氨酸，再次为丙氨酸，尿素产孢最少。

表3 不同碳氮源对病原菌产孢量的影响

3 讨论与结论

烟草棒孢霉叶斑病病原菌大量产孢是实验室研究的基础，因此研究病原菌产孢量的影响因素具有重要意义。本次试验结果显示， 病原菌产孢量最多的碳氮源分别为果糖和硝酸钠，与谭海文等研究最有利于烤烟棒孢霉叶斑病病原菌分生孢子形成的碳氮源为乳糖和硝酸钾的报道不一致。在PSA培养基上，温度30 ℃，pH值7时最适病原菌产孢，最适诱孢方式为：将健康离体烟叶洗净，剪成 2 cm×2 cm长的方块，灭菌冷却后，置于菌饼表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培养。在PDA培养基上，28 ℃最适病原菌产孢，5、10 ℃ 不产孢，与关国经等烤烟棒孢霉叶斑病病原菌在PDA培养基上产孢最适温度为27.5～30.0 ℃，20 ℃ 及以下的各处理产孢很少，10 ℃处理不产孢的结果相似。最适pH值为6，与梁萍等黄脉爵床多主棒孢菌在PDA培养基上产孢适宜pH值为4～8的研究结果类似。最适诱孢方式为将健康离体烟叶洗净，剪成2 cm×2 cm长的方块，灭菌冷却后，置于菌饼表面，12 h培养光照/12 h黑暗交替培养，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培养。与谭海文等研究在PDA培养基上30 ℃ 完全黑暗条件下最利于产孢的报道结果有差异，分析可能与病原菌分离自不同地区有关，谭海文等分离自广西壮族自治区，而本研究病原菌分离自贵州省。大部分植物上分离得到的多主棒孢霉菌在PDA培养基上光暗交替条件最利于产孢，如黄脉爵床、香蕉、木薯、橡胶等，与本研究光暗交替产孢量显著多于全光照和全黑暗的结果一致。

本研究结果表明烟草棒孢霉叶斑病病原菌产孢影响因素，相同条件下烟草棒孢霉叶斑病病原菌在PSA培养基上培养11 d的产孢量比在PDA培养基上的产孢量多。在PSA培养基上，最适产孢温度为30 ℃，产孢量达2.28×10个/皿；最适产孢pH值为7，产孢量达5.03×10个/皿；最适诱孢方式为将健康离体烟叶洗净，剪成2 cm×2 cm长的方块，121 ℃ 高压灭菌20 min冷却后，置于接种的菌饼表面，12 h近紫外光照射/12 h黑暗交替培养，产孢量达1.62×10个/皿。此外，最适病原菌产孢的碳氮源分别为果糖、硝酸钠，产孢量分别为5.12×10个/皿、1.68×10个/皿。