牛华锋，张成东，杨雪娇，任战军，王淑辉，赵永攀

(1.杨凌职业技术学院 动物工程分院，陕西杨 凌 712100；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 7121000；3.陕西畜牧产业试验示范中心，陕西 泾阳 713702)

兔肉被誉为“保健肉”、“美容肉”、“益智肉”，其营养价值愈来愈被消费者认可，国内外市场需求日益增长。培育生长速度快、肉质鲜嫩、屠宰率高的肉兔品种，一直是家兔育种工作关注的热点。肌肉生长抑制素(myostation，MSTN)，又称为转化生长因子8(growth differentiation factor 8,GDF-8)，属于TGF-β超家族[1]，能够负调控骨骼肌的生长，抑制肌肉的生长[2]。大量的研究表明，MSTN基因在哺乳动物中高度保守，MSTN基因突变或敲除后能产生“双肌症状”[3～7]，过表达则会减少肌肉生长，是影响畜禽产肉性状状的主要功能基因之一。分子辅助育种法对于家兔育种至关重要，SNP(single nucleotide polymorphism ,SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性。乔西波等[8](2010)研究了9个纯系肉兔及其37个杂交组合的MSTN基因，发现MSTN基因重要SNP位点突变有利于家兔体躯发育。张柯等[9]研究发现兔MSTN基因外显子1和外显子2的2个SNP位点(分别是194bP，445bP)，2个位点碱基突变显著影响兔135日龄全净膛重、屠宰率和熟肉率。笔者研究比较分析伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因重要SNP位点的基因型及分布情况，探索其对家兔产肉性状有益的分子标记，以期为家兔分子选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选取陕西天鑫兔业有限公司的伊拉肉兔和美系獭兔各70只(公母各35只)。心脏采血10 mL，装入已添加2.5 mL灭菌ACD抗凝剂的离心管中，用冰盒迅速带回实验室，-80℃保存。采用酚-氯仿法提取基因组总DNA，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考http://asia.ensembl.org/ 基因库中兔子MSTN基因外显子Ⅰ、外显子Ⅱ和外显子Ⅲ序列，并用Primer5设计引物，扩增片段长度分别为577bp、749bp和668bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成。引物序列见表1。

表1 MSTN基因外显子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息

1.2.2 基因片段的PCR扩增 PCR扩增总体积为50μL，试验所用2×Taq Master Mix来自康威世纪，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、蓝色染料以及PCR稳定剂和增强剂组成，引物浓度为10pmol/μL，DNA模板浓度为100 ng/μL，PCR各物质添加量及所用扩增程序如表2。

表2 PCR扩增体系及其扩增程序

扩增产物(取5μL)用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用BIO-RAD凝胶成像系统检测扩增结果。

1.2.3 PCR扩增产物测序 各样本均取30μL扩增产物和20μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化、测序。

1.2.4 数据统计 采用MegAlign，Chromas Application 2.3.0.0软件对测序结果进行序列结构分析，通过序列比对和序列峰值校正，筛选出SNP位点，判断出突变位点的基因型。用PopGene32软件进行hardy-weinberg平衡检验，以及基因型频率、等位基因频率、杂合度和有效等位基因数等遗传参数的计算。用PIC计算软件计算出多态信息含量。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测MSTN外显子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR扩增产物，结果显示扩增产物特异性良好，其片段长度分别为668bp、749bp和577bp，片段长度符合预期，适合进行测序。琼脂糖凝胶电泳结果如图1、图2和图3。

图1 外显子ⅠPCR扩增产物电泳检测结果

图2 外显子ⅡPCR扩增产物电泳检测结果

图3 外显子ⅢPCR扩增产物电泳检测结果

2.2 PCR产物测序结果

将样本PCR扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化、测序。结果显示在70只伊拉肉兔和70只美系獭兔MSTN基因中共发现4个SNP位点，分别位于MSTN基因序列外显子Ⅰ的111bp处，内含子Ⅰ的234bp处，外显子Ⅱ的338bp处和内含子Ⅱ的34bp处。外显子Ⅲ中则未发现多态位点。

2.2.1 MSTN外显子Ⅰ和内含子Ⅰ的测序结果 测序结果显示，MSTN外显子Ⅰ的SNP位于111bp处，发生C-T转换，共发现CC基因型、CT基因型和TT基因型3种基因型(见图4)。

图4 MSTN外显子Ⅰ的3种基因型

内含子Ⅰ在的234bp发现1个SNP位点，发生G-A转换，共发现GG基因型、AA基因型和AG基因型3种基因型(见图5)。

2.2.2 MSTN外显子Ⅱ和内含子Ⅱ的测序结果 MSTN外显子Ⅱ在338bp处发现1个SNP，发生T-A颠换，共发现TT基因型、AT基因型和AA基因型3种基因型(见图6)。

测序结果显示，MSTN内含子Ⅱ在34bp处发现1个SNP，发生C-T转换，共发现型CC基因型、TT基因型和CT基因型3种基因(如图7)。

图5 MSTN内含子Ⅰ的3种基因型

图6 MSTN内含子Ⅱ的3种基因型

图7 MSTN内含子Ⅲ的3种基因型

2.3 遗传多态性分析

2.3.1 MSTN基因4个SNP位点基因型频率、等位基因频率分析 笔者研究对伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因4个SNP位点进行了基因型频率、等位基因频率分别进行了分析，结果见表3～表6。

表3 MSTN外显子Ⅰ的111bp处基因型频率和等位基因频率

由表3可知，伊拉肉兔和美系獭兔的MSTN基因外显子Ⅰ的111bp处CC基因型频率显著高于CT基因型和TT基因型；C等位基因频率明显高于T等位基因频率，是两兔群体的优势基因。通过Chi-square适合性检验，该位点各基因型频率分布在伊拉肉兔群体中不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，而在美系獭兔群体中则符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表4 内含子Ⅰ的234bp处基因型频率和等位基因频率

由表4可知，伊拉肉兔和美系獭兔的MSTN基因中内含子Ⅰ的234bp处杂合子GA基因型频率在中最高；G等位基因在伊拉肉兔群体中为优势基因，占0.55；A等位基因在美系獭兔群体为优势基因，占0.5143。通过Chi-square适合性检验，该位点各基因型频率分布在伊拉肉兔群体和美系獭兔群体中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表5 外显子Ⅱ的338bp处基因型频率和等位基因频率

由表5可知，伊拉肉兔和美系獭兔的MSTN基因中外显子Ⅱ的338 bp处杂合子TA基因型频率最高；T等位基因频率均略高于A等位基因频率，为优势等位基因。通过Chi-square适合性检验，该位点各基因型频率分布在伊拉肉兔群体和在美系獭兔群体中都符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

表6 内含子Ⅱ的34 bp处基因型频率和等位基因频率

由表6可知，伊拉肉兔和美系獭兔的MSTN基因内含子Ⅱ的34 bp处杂合子CT基因型频率最高；T等位基因频率均略高于C等位基因频率，为优势等位基因。通过Chi-square适合性检验，该位点各基因型频率分布在伊拉肉兔群体和在美系獭兔群体中均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。

2.3.2 MSTN基因4个SNP位点遗传参数分析 本研究分析了伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因4个SNP位点遗传参数，将MSTN基因外显子Ⅰ的SNP位点记作A，内含子Ⅰ的SNP位点记作B，外显子Ⅱ的SNP位点记作C，内含子Ⅱ的SNP位点记作D。由表7可以看出，伊拉肉兔中A位点的杂合度(0.171 4)和期望杂合度(0.286 1)最低，A位点有效等位基因数在这两个家兔品种中相对较低(分别为1.396 8和1.618 2)，其他三个多态位点有效等位基因数都在1.9以上。在伊拉肉兔和美系獭兔群体MSTN的4个SNP位点(A、B、C、D)均表现为中度多态(0.25

表7 伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因各多态位点的遗传参数

3 讨论与结论

MSTN基因参与骨骼肌的分化，MSTN基因突变的动物骨骼肌肌群分布广泛且肉质优良[10]。笔者研究在70只伊拉肉兔和70只美系獭兔MSTN基因中共发现4个SNP位点，其中外显子Ⅰ和外显子Ⅱ中的多态位点，与张柯等[9]的研究结果一致；外显子Ⅲ未发现多态位点，与乔西波等[8]的研究结果一致；内含子Ⅰ和内含子Ⅱ的多态位点在家兔中首次发现，与其家兔的生长发育是否有关还需要进一步的研究。

在伊拉肉兔群体中外显子Ⅰ的SNP位，三种基因型频率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，其CC基因型为优势基因型，C等位基因为优势基因，这可能是由于C等位基因影响家兔肌肉生长。俞成浩等[10]研究发现在MSTN基因扩增片段中发现SNP位点，27只齐兴肉兔和伊拉肉兔均为CC型。结合已有报道，推断伊拉肉兔较美系獭兔生长速度快或许与此有关，即可认为伊拉肉兔在人工选育的过程中突出肉用性能的选育，强化了C等位基因的选择，导致了该位点不符合hardy-weinberg平衡。

笔者研究在伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因除了伊拉肉兔群体中外显子Ⅰ的SNP位点各基因型频率不符合hardy-weinberg平衡(P<0.05)，内含子Ⅰ、外显子Ⅱ和内含子Ⅱ的3个SNP位点各基因型频率均符合hardy-weinberg平衡(P>0.05)。至于MSTN基因在动物体内发挥作用的分子机制尚不明确，但相关的研究表明，MSTN基因影响畜禽生长发育与肌肉生长。赵振华等[11]发现MSTN基因突变显著影响优质鸡肌肉生长，是鸡肌肉生长主效基因之一。张柯等[9]研究发现MSTN基因SNP位点显著影响了6个肉兔品种135日龄全净膛重、屠宰率等。结合已有的研究，这3个SNP位点基因型频率、等位基因频率分布相似，是由于伊拉肉兔和美系獭兔在品种选育过程对生长速度、屠宰率等肉用指标都作为重用经济指标。

笔者研究表明，伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因各多态位点的遗传参数中，遗传信息含量较高(0.25