赵 志，高 远，舒建洪，孙德君，金 政，赵 凯,6*

（1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校微生物重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；3.台州学院生命科学学院/纳米生物材料与免疫学研究所，浙江 台州 318000；4.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018；5.哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江 哈尔滨 150069；6.浙江洪晟生物科技股份有限公司，浙江 绍兴 312366）

鸡新城疫（Newcastle disease，ND）是由ND 病毒（NDV）引起鸡的呼吸道疾病。NDV 可以感染各生长阶段的鸡。该病发病率较高，但根据鸡日龄不同表现的临床症状略有不同，通常的临床表现为腹泻、呼吸困难、倒提可流出酸臭味液体，甚至大量死 亡[1]。禽 流 感（Avian influenza，AI）是 由AI 病 毒（AIV）引起鸡的一类高度传染性疾病，根据其致病性可分为高致病性和低致病性AIV，H9 亚型属于低致病性AIV[2]。H9 AIV 具有隐性传播的特点，发病鸡临床症状表现不明显，可以导致鸡产蛋量大幅下降并且更易继发其它疾病，同时发病鸡的粪口均会排出大量病毒，迅速感染周围禽类，给养禽业造成了重大经济损失[3]。

疫苗接种是防制ND 和AI 等疾病的主要措施。灭活疫苗具有安全性高、副作用小等特点，但存在抗体产生较慢、抗体水平较低等问题，而在疫苗中添加免疫佐剂可以显著提高灭活疫苗的免疫效果[4]。壳聚糖具有良好的生物相容性、生物降解性和佐剂活性，但其存在水溶性差等问题[5]。针对壳聚糖水溶性差的问题，本研究团队通过将2-羟丙基三甲基氯化铵取代壳聚糖氨基中的氢原子合成了水溶性好且性能更优异的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-HACC），其不但具有壳聚糖的优良特性同时还易溶于水[6]。N,O-羧甲基壳聚糖（CMCS）不仅对细胞无毒性，且具有生物相容性好等特点，由于羧基的引入，羧甲基壳聚糖的水溶性良好，且保留了壳聚糖的生物相容性和生物可降解性等优点。但由于CMCS 带负电荷，不利于其与疫苗抗原的结合，因此，多采用CMCS 与其他壳聚糖衍生物交联制备成微球或纳米粒或水凝胶[7]。本研究将N-2-HACC 和CMCS 交联合成了N-2-HACC/CMCS纳米粒，并以N-2-HACC/CMCS 为佐剂制备了NDV 和H9 AIV 二联灭活疫苗，并利用鸡体内免疫实验评估了该二联灭活疫苗的免疫原性，为N-2-HACC/CMCS 纳米粒在疫苗佐剂中的应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料60 只3 日龄SPF 鸡由哈药集团生物疫苗有限公司提供并饲养；NDV La Sota 株（病毒含量108.5EID50/0.1 mL）、H9 亚型AIV HZ 株（病毒含量107.5EID50/0.1 mL）、NDV+H9 AIV 商品二联灭活疫苗（生产批号202042）、1%鸡红细胞悬液，均由哈药集团生物疫苗有限公司提供；血凝抑制（HI）试验用的鸡NDV、H9 亚型AIV 抗原，购自哈尔滨维科生物技术有限公司；鸡γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）ELISA 检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；白油（Marcol-52）购自美孚石油公司；N-2-HACC 由本实验室合成；CMCS 购 自Sigma 公 司。

1.2 纳米佐剂N-2-HACC/CMCS 的合成及物理性状检测按照本实验室建立的方法合成N-2-HACC/CMCS[8]。通过透射电子显微镜观察N-2-HACC/CMCS的形态，通过激光粒度仪测定N-2-HACC/CMCS 的粒径大小和Zeta 电位。

1.3 N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二联灭活疫苗的制备及检测将NDV La Sota 株和H9 AIV HZ 株灭活病毒液按体积比1：1 混合后，加入N-2-HACC/CMCS（按0.5 mg/mL 病毒混合液的剂量添加），与白油（添加量为病毒液总量的1.3 倍）在12 000 r/min 乳化5 min 后制成N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二联灭活疫苗（简称为佐剂二联灭活疫苗）。根据现行《中国兽药典》要求对制备的疫苗进行外观、剂型、稳定性、无菌和安全性检测[9]。将10 mL 佐剂二联灭活疫苗3 000 r/min 离心15 min，测量离心管底部析出的水相体积，将该疫苗在37 ℃放置21 d 后观察是否破乳，以检测其稳定性；将10 只3 日龄SPF 鸡于颈部皮下接种0.6 mL 佐剂二联灭活疫苗，在14 d 的观察期，观察鸡的生长、精神状态、饮食、注射部位等有无变化，以评价佐剂二联灭活疫苗的安全性。

1.4 疫苗的免疫及免疫后的NDV 和AIV HI 抗体的检测将50 只3 日龄SPF 鸡平均分为5 组，分别于颈部皮下注射佐剂二联灭活疫苗0.2 mL/只、商品二联灭活疫苗0.2 mL/只、佐剂二联灭活疫苗0.3 mL/只、商品二联疫苗0.3 mL/只及空白对照组。在免疫后7 d、14 d 和21 d 分别经翅静脉采血，分离血清，按照现行《中国兽药典》附录3404 HI 试验（微量法）测定免疫鸡血清中NDV 和AIV 的HI 抗体效价，并分析免疫剂量与血清中HI 抗体水平的相关性。NDV HI 抗体效价≥4.0log2 判定为免疫合格，AIV HI 抗体效价≥6.5log2 判定为免疫合格[9]。

1.5 疫苗免疫后血清中细胞因子的检测利用ELI-SA 试剂盒检测1.4 中收集的各免疫组各时间点血清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量。具体操作方法见试剂盒说明书。

2 结 果

2.1 N-2-HACC/CMCS 的物理性状分析通过透射电镜与激光粒度仪检测N-2-HACC/CMCS 的形态、粒径大小和电位，结果显示，N-2-HACC/CMCS 形态呈圆形，粒径大小较为均一（图1A），平均粒径大小为162.6±16.0 nm（图1B），Zeta 电位为32.83±4.24 mV（图1C）。表明，制备的N-2-HACC/CMCS 形态规则、分散性好可用于后续实验。

图1 N-2-HACC/CMCS的形态（A）、粒径（B）及电位（C）分析Fig.1 Analysis of morphology(A),particle size(B)and potential(C)of N-2-HACC/CMCS

2.2 N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二联灭活疫苗的性状检测按照《中国兽药典》要求对佐剂二联灭活疫苗的性状进行检测[9]，结果显示，制备的二联灭活疫苗外观呈乳白色均匀乳剂，剂型为油包水型；将10 mL 二联灭活疫苗3 000 r/min 离心15 min，离心管底部未见水相析出；在37 ℃下放置21 d 未出现破乳，无菌检验符合规定；安全性检验结果显示，10只鸡均健活且注射部位和全身无不良反应。

2.3 免疫鸡血清中NDV 和AIV HI 抗体的测定结果分别在各剂量疫苗免疫后不同时间采血分离血清，通过HI 试验检测血清中NDV 和AIV HI 抗体效价，结果显示，在免疫剂量为0.2 mL 时，佐剂二联灭活疫苗免疫鸡血清中NDV HI 抗体效价均在免疫后7 d、14 d、21 d分别为6.8log2、8.0log2和8.0log2，其中免疫后7 d 和14 d 的HI 抗体效价均极显著高于商品二联灭活疫苗组鸡血清中的NDV HI 抗体效价（4.0log2、5.8log2 和8.0log2）（图2A）（P<0.01）；佐剂二联灭活疫苗免疫鸡血清中AIV HI 抗体效价在免疫后7 d、14 d和21 d 分别为5.8log2、7.6log2 和10.8log2，均极显著高于商品二联灭活疫苗组鸡血清中AIV HI 抗体效价（3.0log2、6.8log2、8.5log2）（图2B）（P<0.01）。

免疫剂量为0.3 mL 时，佐剂二联灭活疫苗免疫鸡血清中的NDV HI 抗体效价在免疫后7 d 、14 d 和21 d 分别为7.0log2、8.0log2 和8.5log2，其中免疫后7 d 和14 d 鸡血清中的HI 抗体效价均极显著高于商品二联灭活疫苗免疫鸡（5.0log2、6.6log2 和8.4log2）（图2A）（P<0.01）；佐剂二联灭活疫苗免疫鸡血清中AIV HI 抗体效价在免疫后7 d、14 d 和21 d 分别为6.0log2、8.0log2 和10.8log2，均极显著高于商品二联灭活疫苗鸡血清中的AIV HI 抗体效价（4.0log2、8.0log2、9.0log2）（图2B）（P<0.01）。空白对照组鸡血清中AIV 和NDV 的HI 抗体效价在免疫后7 d、14 d和21 d 均为0。

上述结果表明，以N-2-HACC/CMCS 为佐剂制备的NDV+AIV 二联疫苗诱导免疫鸡产生的NDV 和AIV HI抗体效价均显著高于商品二联灭活疫苗，免疫原较强性。

2.4 免疫剂量与免疫鸡血清中HI 抗体水平的相关性分析免疫后7 d 和14 d 时，0.3 mL 商品二联疫苗免疫鸡血清中NDV HI 抗体效价均极显著高于0.2 mL商品二联疫苗免疫鸡（P<0.01），而在免疫后21 d 时，0.3 mL 与0.2 mL 商品二联疫苗免疫鸡血清中NDV HI抗体效价差异不显著（P>0.05）；佐剂二联灭活疫苗免疫鸡后7 d、14 d 和21 d 时，0.3 mL 和0.2 mL 免疫鸡血清中NDV HI 抗体效价差异也不显著（P>0.05）（图2）。

图2 免疫鸡血清中NDV（A）与AIV（B）HI抗体水平的测定Fig.2 Determination of NDV(A)and AIV(B)HI antibody levels in serum of immunized chickens

商品二联疫苗免疫鸡后7 d、14 d 和21 d 时，0.3 mL 免疫组鸡血清中的AIV HI 抗体效价均极显著高于0.2 mL 免疫剂量组鸡（P<0.01）；佐剂二联灭活疫苗免疫鸡在免疫后7 d、14 d 和21 d 时，0.3 mL 免疫鸡与0.2 mL 免疫鸡血清中的AIV HI 抗体效价差异不显著（P>0.05）。

综上，免疫0.3 mL 商品二联灭活疫苗鸡产生的NDV 和AIV HI 抗体效价较免疫0.2 mL 该疫苗鸡产生的NDV 和AIV HI 抗体效价更高，免疫剂量和抗体效价呈正相关；而分别免疫0.3 mL 和0.2 mL 佐剂二联灭活疫苗免疫鸡产生的NDV 和AIV HI 抗体效价基本相近，且抗体效价均较高，免疫剂量和抗体效价无相关性，且佐剂二联灭活疫苗免疫鸡比商品二联灭活疫苗免疫鸡产生了更高的NDV 和AIV HI 抗体效价。表明N-2-HACC/CMCS 不仅可以提高免疫鸡血清中NDV 和AIV HI 抗体效价，而且还可以减少疫苗制备中的抗原用量。

2.5 免疫鸡血清中细胞因子的测定结果通过ELISA试剂盒检测各免疫组鸡血清中IFN-γ、IL-2 和IL-4 含量。结果显示，免疫后21 d，0.2 mL佐剂二联灭活疫苗和商品二联灭活疫苗免疫鸡血清中的IFN-γ、IL-2、IL-4 含量均极显著高于免疫后7 d 和14 d 相应各组鸡血清中的相应细胞因子含量（P<0.01），而在免疫后21 d，0.3 mL 佐剂二联灭活疫苗和商品二联灭活疫苗免疫鸡血清中IFN-γ、IL-2、IL-4含量与免疫后7 d和14 d相比无明显升高（图3）（P>0.05）。

免疫后7 d、14 d和21 d，免疫0.2 mL 佐剂二联灭活疫苗组鸡血清中IFN-γ（68.80 pg/mL、106.13 pg/mL、136.77 pg/mL）、IL-2（341.75 pg/mL、379.04 pg/mL、443.51 pg/mL）、IL-4（147.15 pg/mL、167.13 pg/mL、233.24 pg/mL）的含量均极显著高于其他免疫组（P<0.01）（图3），表明0.2 mL 佐剂二联灭活疫苗即可以很好地促进免疫鸡细胞因子的表达。

图3 免疫鸡血清中IL-2、IFN-γ、IL-4含量的测定Fig.3 Detection of cytokines in serum from immunized chickens

3 讨 论

佐剂能够提高抗原的免疫效果，且不同佐剂的免疫增强作用存在差异[10-11]。董浩苏等证明了壳聚糖具有免疫增强作用[12]，与本实验中的N-2-HACC/CMCS 作为佐剂可以提高NDV 和AIV HI 抗体效价和相应细胞因子含量的结论相同。

李新生等的研究显示，NDV、鸡传染性支气管炎病毒和AIV（H9）三联灭活疫苗免疫剂量与血清HI抗体效价量呈正相关[13]。本实验结果显示，随着免疫剂量的增加，商品二联灭活疫苗免疫鸡血清中的HI 抗体水平也相应增加。但王丽萍等报道，高剂量的灭活疫苗会影响鸡对饲料中钙和磷的利用率，从而对产蛋率产生不利影响[14]。本研究结果显示N-2-HACC/CMCS 为佐剂的NDV+AIV 二联疫苗的免疫剂量和鸡的抗体效价无相关性，0.2 mL 佐剂二联灭活疫苗免疫鸡即产生了较好的免疫效果，可以有效避免高剂量灭活疫苗影响鸡产蛋率这一问题。

IFN-γ 和IL-2 为Th1 型细胞因子，IL-4 为Th2 型细胞因子。本实验中0.2 mL 的佐剂二联灭活疫苗即可诱导鸡产生更高水平的IFN-γ、IL-2 和IL-4，表明N-2-HACC/CMCS 能够在诱导Th2 型免疫反应的同时更好的诱导Th1 型免疫反应。彭越等研究显示，N-2-HACC/CMCS 可以通过激活cGAS-STING 信号通路更好的诱导细胞免疫[15]。本研究中免疫剂量为0.3 mL 时的疫苗均未能诱导更高水平的IFN-γ、IL-2和IL-4，刘海斌等同样认为机体的免疫应答需要在一定的疫苗剂量范围之内，这可能由于疫苗中用于病毒灭活的化学物质在高剂量时会导致机体应激水平的增强，从而产生免疫麻痹[16]。上述结果表明，低剂量N-2-HACC/CMCS 制备的疫苗在保证免疫效果的同时安全性更高。

综上所述，N-2-HACC/CMCS 可以作为NDV 和AIV 灭活疫苗的有效佐剂，且制备的N-2-HACC/CMCS NDV+H9 AIV 二联灭活疫苗免疫剂量为0.2 mL即可达到较好的免疫效果。本研究为纳米佐剂在禽类灭活疫苗中的应用提供了参考依据。