黄丽霞，梁琪妹，李绍波，刘 征，曹树威，罗鲜青，黄 香，唐承明，韦明松，陆晶山，何仁春，周志扬

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西 南宁 530001；2.广西壮族自治区柳州种畜场，广西 柳州 545205)

反刍动物养殖作为畜牧业重要组成部分发展到今天，集中养殖，规模舍饲的方式已经逐渐替代传统的放牧养殖。青贮技术正是在此现实条件下，实现规模化储藏、加工青绿饲料，满足舍饲青绿饲料供给的主要方式。反刍动物瘤胃中的微生物通过发酵作用将青贮饲料中的植物蛋白、纤维等转化为微生物蛋白、动物蛋白前体物质、脂类、有机酸等，以供反刍动物生长所需。从生物化学的角度来说，直接将植物蛋白转换为微生物蛋白或者动物蛋白前体物质比将植物纤维转换为微生物蛋白或者动物蛋白前体物质等容易，相对效率更高。因此，蛋白质含量是衡量青绿饲料营养价值水平的重要指标[1]。青绿饲料作为反刍动物最主要的饲料来源，在当前的反刍动物饲养规模下，存有巨大的消耗体量，受其规模影响，其主要的营养价值指标如蛋白质、纤维等如能有所改善，对行业整体来说都是巨大的经济效益提升。

青贮青绿饲料中蛋白质的来源主要由青绿饲料自带植物蛋白以及微生物增殖的微生物蛋白组成，一般条件下，提高青贮饲料中粗蛋白含量只能依靠微生物大量增殖来生成菌体蛋白，而粗纤维的降低也只能依靠微生物代谢分解。大量研究表明，利用霉菌、真菌等微生物的有氧发酵是当前可以显著降低纤维素含量[2-4]，同时能大量产出菌体蛋白的发酵方式[5]，但有氧发酵大规模生产需要更为严苛的工艺及更昂贵的生产成本，因而难以得到有效的推广。传统的青贮技术以乳酸菌、芽孢杆菌等菌种作为主要的发酵菌种，以无氧发酵作为主要的发酵方式[6]，虽然增加蛋白含量、降低纤维含量的能力有限，但技术要求简单便捷，生产工艺较为成熟，所以仍被广泛应用。随着技术的进步以及行业的发展需要，青贮技术的研究目标应该由“保营养、延贮存”逐步向“增营养、延贮存”转变，菌种与工艺作为把控青贮品质的两个最为主要的因素，就成为当前有关青绿饲料微生物发酵领域的重要研究方向[7]。

本试验选取了较为常见的甘蔗尾叶和玉米秸秆作为主要研究对象，以自然发酵菌种、活力99商用菌种、自筛菌种作为主要的发酵用菌种，分别对甘蔗尾叶和玉米秸秆进行青贮发酵，发酵完成后对其基础营养指标以及氨基酸组成进行检测与评分。本试验中所采用的自筛菌种主要由米曲霉菌(好氧菌)搭配植物乳杆菌(厌氧或兼性厌氧)，且发酵工艺为初期有氧发酵与后期无氧发酵结合，而其他对照组及试验组主要以厌氧菌为主，发酵方式均为单一无氧发酵。本试验在试验设计之初，充分考虑发酵菌种类型、发酵工艺、不同发酵底物的差异化，在霉菌属应用以及多种发酵方式结合的层面进行初步的探索，以期为青绿饲料资源青贮化利用提供一定的参考。

1 试验材料、设备及方法

1.1 试验材料与设备

试验所用甘蔗尾叶和玉米秸秆均来自于南宁周边地区。

试验地点为广西壮族自治区畜牧研究所动物营养研究室。

试验所用主要仪器设备：Kjeltec TM 8400 凯氏定氮仪，Soxtex 8000 全自动脂肪分析仪，Fibertec 8000 全自动纤维分析仪，丹麦福斯分析仪器公司; 5E-AC8018 氧弹式量热仪，长沙开元仪器设备有限公司;PHS-3C pH测定仪上海雷磁;LA8080 全自动氨基酸分析仪，日本日立集团。

所有实验试剂采用分析纯及以上级别。

自筛菌种为米曲霉菌(中国典型培养物保藏中心，XMS01，编号：CCTCC NO：M 2018425，米曲霉菌液血球计数法65.0×106CFU/ml)植物乳杆菌1(中国典型培养物保藏中心，XMS02，编号：CCTCC NO：M 2019002)和植物乳杆菌2(中国典型培养物保藏中心，XMS03，编号：CCTCC NO：M 2019003)组合，商品菌为活力99多功能饲料发酵剂(枯草芽孢杆菌≥56.0×106CFU/g，沼泽红假单胞菌≥20.0×106CFU/g，乳酸菌≥4.0×106CFU/g)。

1.2 试验方法

1.2.1分组设置

每一种青绿饲料分3个组，每组设3个重复，每个重复取3 kg新鲜青绿饲料经切割、粉碎、揉搓至0.5～3 cm长度后开展试验。自然发酵组喷洒无菌水200 ml/kg。自筛菌种组分2个阶段进行，第一阶段有氧发酵：样品喷洒米曲霉菌液10 ml/kg和无菌水90 ml/kg，在无菌室室温下有氧发酵2 d；第二阶段为无氧青贮：喷洒10 ml/kg植物乳杆菌XMS02菌液+10 ml/kg植物乳杆菌XMS03菌液+80 ml/kg无菌水。商品菌种组按照产品使用说明活化后，以200 ml/kg的比例加入到青绿饲料中。菌种混合均匀后，将各组青绿饲料样品装于带单向排气阀的青贮袋中，并充分挤压排气后贮藏发酵，30 d后取出发酵样品进行各项检测。

1.2.2检验检测

水分及干物质测定采用烘干法检测；粗蛋白质检测参照国标GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》；粗脂肪检测参考国标GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》；中性洗涤纤维检测参考国标GB/T 20806—2006《饲料中中性洗涤纤维(NDF)的测定》；酸性洗涤纤维测定参考NY/T 1459—2007《饲料中酸性洗涤纤维的测定》；pH测定：青贮开封以后将样品混合均匀，每袋取35 g样品，放入250 ml广口瓶中，添加150 ml超纯水，置于4℃冰箱中，每4 h摇匀1次，24 h后经2层纱布进行过滤，取滤液使用pH计测定；氨基酸检测参考国标GB/T 18246—2019《饲料中氨基酸的测定》，并稍加改动。

1.2.3数据处理

采用EXCEL及spss 19.0对试验数据进行分析与处理，结果采用“平均值±标准差”表示。以不同青绿饲料资源与不同微生物菌剂处理为因素对各青贮饲料营养指标以及氨基酸组成进行单因素方差分析。参照钱爱萍等[8]的方法，以联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)提出的 FAOWHO必需氨基酸模式[9]以及全蛋理想氨基酸模式分别计算各发酵青绿饲料氨基酸分(AAS)以及氨基酸化学分(CS)，计算方法如下计算公式，各标准模式必需氨基酸含量见表1。

表1 FAOWHO以及全蛋标准模式必需氨基酸含量 g/(100 g)

2 试验结果与数据分析

2.1 不同菌种对相同青绿饲料资源发酵后营养价值的影响

2.1.1不同菌种对玉米秸秆发酵后营养价值的影响

不同菌种对玉米秸秆发酵后营养价值的影响见表2。

如表2所示，使用3种不同的发酵菌种对玉米秸秆进行微生物发酵青贮，试验结果表明：自然发酵组初水分最高，商品菌种组最低，但3组之间差异不显著(P>0.05)；自筛菌种发酵玉米秸秆干物质含量最低，与其他组差异显著(P<0.05)，其他组之间差异不显著(P>0.05)；自筛菌种组粗蛋白质含量最高，商品菌种最低，但三组之间差异不显著(P>0.05)；自筛菌种组粗脂肪含量最高，商品菌种组最低，但3组之间差异不显著(P>0.05)；3组玉米秸秆青贮酸性洗涤纤维与中性洗涤纤维含量差异不显著(P>0.05)；自筛菌种组pH值最低，商品菌种组最高，但3组之间差异不显著(P>0.05)；自筛菌种发酵玉米秸秆青贮能量水平最高，商品菌种组最低，3组之间相互差异显著(P<0.05)。

表2 不同菌种对玉米秸秆发酵后营养价值的影响

2.1.2不同菌种对甘蔗尾叶发酵后营养价值的影响

不同菌种对甘蔗尾叶发酵后营养价值的影响见表3。如表3所示，使用3种不同的发酵菌种对甘蔗尾叶进行微生物发酵青贮，试验结果表明：自筛菌种发酵组甘蔗尾叶初水分最高，商品菌发酵组最低，但3组之间无显著性差异(P>0.05)；自然发酵组干物质含量最高，且显著高于其他2组(P<0.05)，其他2组之间差异不显著(P>0.05)；3组发酵甘蔗尾叶粗蛋白质含量相互之间差异显著(P<0.05)，其中自筛菌种组最高，自然发酵组居中，商品菌种组最低。自然发酵甘蔗尾叶组粗脂肪含量最低，商品菌种组最高，二者之间差异显著(P<0.05)，自筛菌种发酵组居中，且与其他试验组之间差异均不显著(P>0.05)；自然发酵甘蔗尾叶酸性洗涤纤维含量与商品菌组接近，二者之间差异不显著(P>0.05)，且二者均显著高于自筛菌种组(P<0.05)。3组发酵甘蔗尾叶中性洗涤纤维含量相互之间差异显著(P<0.05)，其中商品菌种组最高，自筛菌种组最低，自然发酵组居中；商品菌种组甘蔗尾叶pH值与能量值均显著高于其他2组(P<0.05)，其他2组之间差异不显著(P>0.05)。

表3 不同菌种对甘蔗尾叶发酵后营养价值的影响

2.2 不同菌种对青绿饲料资源发酵后氨基酸组成及必需氨基酸评分的影响

2.2.1不同菌种对玉米秸秆发酵后氨基酸组成及必需氨基酸评分的影响

不同菌种对玉米秸秆发酵后氨基酸组成的影响见表4。如表4所示，使用3种不同的发酵菌种对玉米秸秆进行微生物发酵青贮，并于发酵试验完成后测定其氨基酸组成，测定结果表明：玉米秸秆在相同的发酵条件下使用不相同的发酵菌种，发酵后其氨基酸组成存在一定的差异。

表4 不同菌种对玉米秸秆发酵后氨基酸组成的影响

3组玉米秸秆发酵后氨基酸总量TAA相互之间差异显著(P<0.05)，其中使用自筛菌种的玉米秸秆经发酵后氨基酸总量TAA最高，而自然发酵菌种发酵玉米秸秆的氨基酸总量TAA最低；自筛菌种发酵玉米秸秆必需氨基酸EAA含量最高，与活力99商品菌种差异不显著(P>0.05)，但2组均显著高于对照组(P<0.05)；自筛菌种发酵玉米秸秆非必需氨基酸NEAA含量最高，自然发酵菌种最低，且3个试验组之间差异显著(P<0.05)；自然发酵组EAA/TAA以及EAA/NEAA均为最高，与活力99商品菌种差异不显著(P>0.05)，但二者均显著高于自筛菌种(P<0.05)。各必需氨基酸对应的氨基酸分AAS及氨基酸化学分CS值最低者为其限制氨基酸。

不同菌种对玉米秸秆发酵后必需氨基酸评分的影响见表5。

如表5所示，FAO/WHO及全蛋模式下，采用自然发酵和自筛菌种发酵方式的玉米秸秆，其第一限制氨基酸均为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸均为赖氨酸，而采用活力99商品菌种发酵的玉米秸秆其第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸为异亮氨酸。

表5 不同菌种对玉米秸秆发酵后必需氨基酸评分的影响

2.2.2不同菌种对甘蔗尾叶发酵后氨基酸组成及必需氨基酸评分的影响

不同菌种对甘蔗尾叶发酵后氨基酸组成的影响见表6。

如表6试验数据所示，自筛菌种发酵甘蔗尾叶其TAA和EAA均显著高于自然发酵组及活力99发酵组(P<0.05)，活力99商品菌种组与自然发酵组之间差异不显著(P>0.05)；自筛菌种组NEAA同样也是最高，自然发酵菌种次之，活力99商品菌种组最低，且三组之间差异显著(P<0.05)；活力99商品菌种组EAA/TAA和EAA/NEAA显著高于其他2组(P<0.05)，自筛菌种稍低于自然发酵组，但二者之间差异不显著(P>0.05)。

表6 不同菌种对甘蔗尾叶发酵后氨基酸组成的影响

表7所示为不同菌种发酵甘蔗尾叶后必需氨基酸的评价。由表中数据可知，自然发酵甘蔗尾叶采用FAO/WHO模式时其第一限制氨基酸均为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸为苏氨酸，而采用全蛋模式时，其第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸为苯丙氨酸+酪氨酸；自筛菌种发酵甘蔗尾叶使用FAO/WHO模式时，第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸为赖氨酸，采用全蛋模式时，第一限制氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸为苯丙氨酸+酪氨酸；活力99商品菌种发酵甘蔗尾叶使用FAO/WHO模式及全蛋模式时其第一限制氨基酸均为蛋氨酸+胱氨酸，第二限制氨基酸均为赖氨酸。

表7 不同菌种对甘蔗尾叶发酵后必需氨基酸评分的影响

3 讨论

3.1 不同发酵菌剂对不同粗饲料资源发酵后基础营养成分的影响

青绿饲料在青贮的过程中会因为自身的酶解反应以及优势微生物的增殖与代谢导致发酵完成后其营养成分与未发酵之前的差异[10-11]。自然发酵主要是利用青绿饲料自带的微生物进行发酵的过程，其微生物种类比较复杂，不仅包括芽孢杆菌、乳酸菌等发酵有益菌，还可能含有很多如霉菌等有害及竞争性杂菌，因此采用自然发酵的青绿饲料虽然在后期会因为氧气耗尽而进入由产乳酸菌主导的酸性环境，但因其杂菌的不可控以及发酵过程的竞争，导致自然发酵一般均不能达到较好地提高发酵青绿饲料营养价值的目的[12]。从本试验总体结果综合看来，人工添加外源发酵菌剂的组别，其发酵效果均会相较于自然发酵有一定程度的改善，甚至针对部分青绿饲料资源的某些关键营养指标如粗蛋白、纤维等有了显著性的改善，这说明通过人工添加菌种，建立发酵过程中的优势菌群，从而在一定程度上把控青绿饲料的发酵效果是可行的。但同时也需要看到，即使是相同的菌种在发酵不同的青绿饲料资源时也会出现不尽相同的发酵结果，某些营养指标甚至会出现消极影响。这可能是因为不同发酵底物能提供的发酵条件不尽相同，因此会对添加的菌种的繁殖与代谢造成影响，同时也表明想要达到理想的发酵效果，针对不同的发酵青绿饲料应该依据其不同的营养特性而选择不同的发酵菌种，而不是盲目的使用“万能菌种”[13]。以主要的发酵后营养成分为分析指标，自筛菌种的米曲霉+植物乳杆菌的组合及其两段式的发酵方式在玉米秸秆、甘蔗尾叶的发酵中有很好的应用效果，其关键指标均能实现较为明显的改善。

3.2 不同发酵菌剂对不同粗饲料资源发酵后氨基酸组成的影响

蛋白质含量是衡量青绿饲料资源品质高低与否的一个重要的指标，一般认为较高的粗蛋白质含量代表其蛋白质营养较好，因此具有较高的营养价值。但动物对蛋白质的需求，本质上是对组成蛋白质的氨基酸的需求，而氨基酸具有许多不同的种类，理想科学的氨基酸组成及比例才能更适合动物的生长发育需要，而不科学合理的氨基酸组成与比例，即使在宏观上能表现出较高的蛋白质含量，但实际其蛋白质营养效价较低[14]。

外源添加不同的发酵菌剂发酵玉米秸秆，发酵完成后玉米秸秆的TAA、EAA、NEAA相较于自然发酵均有显著提高，而3种发酵玉米秸秆的EAA/TAA以及EAA/NEAA分别为36.6%、32.4%、35.6%和57.7%、47.9%、55.3%。一般在对蛋白质进行评价时认为EAA/TAA以及EAA/NEAA分别超过40%和60%时是较好的蛋白质营养来源，可见外源添加菌剂虽然提高了玉米秸秆的TAA、EAA、NEAA等绝对值，但实际上对玉米秸秆的合理氨基酸组成与比例有不利影响。使用不同发酵菌剂发酵甘蔗尾叶时，自筛菌种相较于自然发酵和活力99商品菌种，显著提高了甘蔗尾叶的TAA、EAA、NEAA，且此时3组甘蔗尾叶的EAA/TAA以及EAA/NEAA分别为38.8%、38.6%、41.3%和63.5%、62.9%、70.2%。由此可见，自筛菌种不仅能提高甘蔗尾叶的氨基酸营养量，同时对氨基酸合理组成并没有不利影响，同时活力99商品菌种虽然不能大幅提高甘蔗尾叶的氨基酸总量，但对其氨基酸合理组成有一定的积极影响。

3.3 不同发酵菌剂对不同粗饲料资源发酵后氨基酸评分的影响

氨基酸分(AAS)以及氨基酸化学分(CS)是用来衡量蛋白质中某些必需氨基酸与FAO/WHO以及全蛋模式等理想参考蛋白模式中相应必需氨基酸含量的接近程度的数值，也是常见的用来评判蛋白质营养价值的重要参数。一般认为，某种必需氨基酸的AAS以及CS分越高，则代表该种必需氨基酸营养越丰富，相应的某种必需氨基酸的AAS或CS分值越低，则表明该种氨基酸营养越匮乏，而最低的分值则对应其主要的限制性氨基酸。

本试验中，使用不同的发酵方式发酵玉米秸秆、甘蔗尾叶，各组发酵后的AAS及CS分均表明第一限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸。而不同的菌种以及不同的青绿饲料资源，其第二限制氨基酸却有所不同，这可能是因为青绿饲料本身的蛋白质营养组成有所差异，也有可能是因为不同菌种的代谢需求与产出的影响，同时也可能是因为不同的理想蛋白模式必需氨基酸标准的差异影响。从本试验的结果可以看出，使用该3种发酵菌剂发酵玉米秸秆以及甘蔗尾叶时，其第一限制氨基酸是统一的，均为蛋氨酸+胱氨酸，而第二限制氨基酸则可能是苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸，这与那亚等对草甸草原牧草青贮料氨基酸组成于营养价值的研究结果相近[15]。

在常见猪禽日粮中，蛋氨酸通常为第一或第二限制性氨基酸，而反刍动物因其特殊的蛋白代谢方式，其主要的限制性氨基酸以及饲粮的蛋白营养评价机制仍然不太明晰[16-17]。采用FAO/WHO或全蛋标准模式来评价发酵饲料的蛋白质营养价值存在一定的缺陷，但其对单胃动物的饲料评价还是具有一定的意义。需要注意的是，粗饲料在经过反刍动物瘤胃时还需要经历再一次发酵过程，因此在进入瘤胃前对发酵青绿饲料氨基酸组成的评价并不一定准确，即使从本试验的结果来看，外源发酵菌剂可能会对发酵青绿饲料的氨基酸组成以及限制性氨基酸评分等造成一定的影响，但其TAA以及EAA、NEAA绝对值的增加可以促进在进入瘤胃后氨代谢总量的增加。

4 结论

(1)总体上外源发酵菌剂的加入，大部分情况下均可以使青绿饲料资源的某些关键营养指标如粗蛋白质、纤维等有一定的改善。

(2)不同的青绿饲料资源对不同的发酵菌剂有明显的适应性倾向，就本试验而言自筛菌剂更适合于玉米秸秆以及甘蔗尾叶的发酵。

(3)自筛菌种相较于其他2种菌种在玉米秸秆与甘蔗尾叶的发酵中具有更好的效果，但需要注意的是自筛菌种不仅菌种本身组成异于其他组别，且发酵方式为两段式发酵，具体是因为菌剂的差异还是发酵方式的差异导致发酵结果的不同，还需要进一步探讨。

(4)2种外源菌剂的发酵参与，一般情况下均可以提高发酵青绿饲料资源的TAA、EAA、NEAA总量，但对青绿饲料的EAA/TAA以及EAA/NEAA有一定的消极影响，即对青绿饲料资源的氨基酸组成与比例有一定程度的不利影响。

(5)不同的微生物发酵的玉米秸秆与甘蔗尾叶其第一限制氨基酸均为蛋氨酸+胱氨酸，而第二限制氨基酸则因为青绿饲料本身、菌种、参照模式的不同而可能是苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸等。