祖未希，赵晓霞，高 芬

（1太原旅游职业学院酒店管理系，太原 030032；2山西大学应用化学研究所，太原 030006）

0 引言

黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus，AMM)或膜荚黄芪(A.membranaceus)的干燥根，性温、味甘，具补气固表、托疮生肌等功效，是药用价值很高的中药材[1]，并在2012年被纳入药食同源目录，其主要药效成分包括黄酮类、皂苷类、多糖等。近年来，黄芪被广泛用于临床各科和日常保健，市场需求量逐年攀升。然而，由于黄芪野生资源日益匮乏，移栽黄芪且主要是蒙古黄芪开始大规模种植，并占据了市场份额的90%以上[2]。山西作为蒙古黄芪的主产区，移栽芪的生产也步入了快车道，但随之有2个问题开始在生产中日益凸显，一是被称为“植物癌症”的根腐病发生日渐广泛和严重[3-4]，且目前无论化学防治还是农业手段，均无法有效控制其危害[5]；二是研究发现，移栽芪中的某些药效成分如毛蕊异黄酮葡萄糖苷[6-7]、芒柄花苷[7]、皂苷[7-8]、多糖[6,9]等的含量显著低于野生芪。药效成分的稳定性和均一性是确保中药材质量及中医临床用药安全有效的关键[10]。移栽芪药效成分含量变化导致的品质下降，也成为阻碍黄芪产业可持续发展不可忽视的因素。

利用拮抗微生物特别是芽孢杆菌(Bacillus spp.)来防治植物病害，一直是国内外的研究热点，以其为主体因子开发的生防制剂，在多种农作物土传病害防治上显示出了良好的效果。近年来，随着中医药产业的发展，利用拮抗芽孢杆菌防治中药材土传病害，也越来越被科研人员所关注，特别是针对人参根腐病，关一鸣等[11]筛选获得了能强烈抑制人参根腐病菌(Fusarium solani)菌丝生长和孢子萌发的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B11。KIM等[12]发现了可防治人参根腐病(Cylindrocarpon destructans)的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)AK-0。对于黄芪根腐病，本课题组前期也开展了一系列的相关研究，萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)SXKF16-1[13]和枯草芽孢杆菌G10(B.subtilis)[3]均对由腐皮镰刀菌(F.solani)和锐顶镰刀菌(F.acuminatum)引起的根腐病有明显的离体防病效果。此外，芽孢杆菌在调节植物营养成分，提升中药材药效成分含量方面也多有报道。枯草芽孢杆菌FZB24可以提高藏红花中番红花苦苷、番红花酸和藏红花醛的含量[14]。内生芽孢杆菌(B.endophyticus)AMR83能显著促进白术根部活性成分挥发油的积累[15]。内生多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)[16]和多粘芽孢杆菌菌剂[17]对人参生长和皂苷累积均起到了促进作用。由此可见，筛选利用具有“抗病提质”效力的多功能菌株，并将其开发为生防制剂，不仅有利于对中药材病害进行有效防控，还可在一定程度上提升药效成分，满足中药材生产中对产量和质量的多重要求。

1 材料与方法

1.1 供试材料

病原菌：黄芪根腐病菌锐顶镰刀菌(F.acuminatum)和腐皮镰刀菌(F.solani)，由本课题组分离、鉴定并保存。

拮抗菌：菌株R57，由本课题组筛选获得并保存。

植物材料：蒙古黄芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus；AMM)，以下统一简称为黄芪。试验室盆栽种植5～6个月，取长势基本一致的幼苗，用于离体防病试验；采自山西应县黄芪种植基地的一年生黄芪（根长10～15 cm左右，直径3～6 mm），用于盆栽防效和药效成分影响试验。

试验在山西大学完成，2014年4月—2016年6月进行拮抗菌筛选、平皿及离体防病试验；2016年10月—2017年6月间进行盆栽防病和功能菌株形态和生理生化鉴定；2019年10月—2021年6月进行药效成分影响试验和功能菌株分子鉴定。

1.2 仪器与试剂

仪器：Waters e2695液相色谱仪（配备Waters 2489紫外可见检测器、Chromachem ELSD检测器、Empower色谱工作站）。试剂：乙腈和甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；对照品为毛蕊异黄酮葡萄糖苷(CAS NO.20633-67-4)、芒柄花素(CAS NO.485-72-3)、黄芪皂苷I(CAS NO.84680-75-1)、黄芪皂苷IV(CAS NO.84687-43-4)均购于上海永恒生物科技有限公司；芒柄花苷(CAS NO.486-62-4)、毛蕊异黄酮(CAS NO.20575-57-9)购于成都曼斯特公司。上述标准品质量分数均大于98%。

1.3 菌株R57抑菌防病效果的测定

1.3.1 无菌发酵滤液的平板抑菌活性 牛津杯法测定抑菌活性[3]。病原菌孢子悬液和菌株R57无菌发酵液制备均参照文献进行，发酵培养基为R57专用培养基。试验以无菌水为对照，3次重复。

1.3.2 无菌发酵滤液的离体防病效果 浸根法测定离体防效[13]。试验中病原菌孢子悬液制备同1.3.1，终浓度1.5×106cfu/mL～2.5×107cfu/mL；菌株R57无菌发酵液制备同1.3.1。7天和15天记录发病情况，病情指数表示发病程度，根腐病分级标准参照文献[13]。对照和重复设置同1.3.1。

逝者如斯，一晃轮到柳知客家带孙媳妇了。正在大家欢欣鼓舞前往合家欢时，却被柳知客家门前贴的一张启示（“事”被柳知客误写为“示”）拦住了——

1.3.3 发酵液的盆栽防病效果 将采自种植基地的黄芪采用1.3.2方法洗净、消毒；栽种前用钢丝球轻微刮擦根部，制造少许伤口，待用。病原菌孢子悬液制备同1.3.2；R57发酵液制备同1.3.1，但不去除菌体。试验设4个处理：A为黄芪栽入花盆后，仅浇灌R57发酵液500 mL（阴性对照）；B为黄芪根在50 mL病原菌孢子悬液中浸泡60 min后栽入花盆，剩余悬液浇入土中（阳性对照）；C为保护性处理：将黄芪根在R57发酵液500 mL中浸泡15 min后栽入花盆，剩余的发酵液浇入土中；常规培养72 h后，用病原菌孢子悬液灌根（50 mL/盆）；D为治疗性处理：将黄芪根在50 mL病菌孢子悬液中浸泡60 min后栽入花盆，剩余悬液浇入土中；常规培养72 h后，用R57发酵液灌根（500 mL/盆）。每处理3次重复（3盆），每盆8～10株黄芪。人工气候室培养30天后[(25±1)℃，光照交替12/12 h]，记录各处理黄芪发病率，并计算防效。以上土壤为经高温灭菌的无菌土。

1.4 菌株R57对黄芪药效成分影响的分析

1.4.1 黄芪的种植与处理 将采集自种植基地的黄芪幼苗种植于花盆中（8～10株/盆），缓苗40天，常规管理。菌株R57发酵液制备同1.3.3。发酵液分3次浇注，间隔10天，每次浇液量为150 mL/kg土壤。以蒸馏水为对照，3次重复。黄芪培养60天后（条件同1.3.3）记录生长情况，采集根部，-80℃保存，用于药效成分测定。

1.4.2 对黄芪总多糖含量的影响 苯酚-硫酸比色法测定总多糖含量，总多糖提取和样本制备参照文献[6]。用无水葡萄糖对照品制定标准曲线，标准曲线方程为：y=0.0635x+0.0196，R²=0.9973，葡萄糖在4.10～14.35 µg范围内线性关系良好。488 nm波长下测定样本吸光度完成后，依据标准曲线计算溶液中总多糖含量。

1.4.3 对黄酮类和皂苷类含量的影响 HPLC-UVELSD法测定黄酮类和皂苷类含量，条件及样本制备均参照本实验室建立的方法[18]。标准品和待测品溶液用0.22 μm有机相滤膜过滤，进样20 μL。测定完成后，将4种黄酮的含量相加得总黄酮的含量，2种皂苷的含量相加得总皂苷含量。

以上活性成分测定时每生物学重复均以3次技术重复测定。

1.5 菌株R57的分类鉴定

1.5.1 形态、生理生化特征观察 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[19]和《常见细菌系统鉴定手册》[20]，观察菌株R57的菌落形态与颜色、革兰氏染色和芽孢染色等特征，并测定其生理生化特性。

1.5.2 16S rDNA序列测定与分析 菌株R57基因组DNA提取和PCR扩增均参照本实验室建立的方法[21]。扩增产物送上海生工测序，所得基因序列与GenBank中的已知序列进行同源性比对，运用MEGA 5.05构建系统发育树。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2016处理数据，SPSS 16.0进行Duncan’s新复极差检验和t检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株R57的抑菌防病效果

以F.solani为靶标测定菌株R57无菌发酵滤液的抑菌活性时，抑菌圈清晰透明，边缘整齐，直径为(18.02±1.71)mm；以F.acuminatum为靶标时，抑菌圈透明度和边缘整齐度均略弱于前者，直径为(19.96±2.42)mm。结果表明：菌株R57对2种病原菌均具有良好的抑菌活性，但抑菌效果存在差异。

离体防病试验中，只加入菌株R57发酵液和PD培养液的对照组，黄芪均不发病；F.solani接种组的黄芪根部在7天即开始明显发病，病情指数为58.33±2.08，此后随时间延长发病加重，15天病情指数达66.67±2.78；F.acuminatum接种组发病情况同F.solani接种组，7天病情指数为50.00±25.00，15天病情指数达72.22±4.81。菌株R57无菌发酵液的不同处理方式，对2种病原菌的致病情况表现出不同防效。针对F.solani侵染，R57保护处理在7天时表现出显著防病效力；治疗处理在7天和15天均表现出显著防病效力；拮抗处理仅在7天时有明显防效。针对F.acuminatum侵染，R57保护处理在15天时有显著防病效力；治疗处理在7天和15天均表现出显著防效；拮抗处理则无防病效力。可以看出，菌株R57发酵液对由F.solani和F.acuminatum侵染引起的根腐病，具有治疗性和保护性的离体防病效果（表1）。

表1 菌株R57无菌发酵液的离体防病效果

盆栽防效试验中，仅浇灌R57发酵液的黄芪苗长势良好，无发病症状；接种2种病原菌的处理地上部分发病不明显，但根部均出现了黑色或褐色斑点，少数有腐烂发生。菌株R57发酵液施用对由F.solani和F.acuminatum接种引起的根腐病均显示出较好的保护性防病作用，防效分别为61.27%±4.89%和64.33%±8.25%；治疗性处理也显示出了一定效果，但较保护性防效低，均未超过50%（表2）。

表2 菌株R57发酵液的盆栽防病效果

2.2 菌株R57对黄芪药效成分的影响

盆栽黄芪幼苗浇注菌株R57发酵液后，生长期间长势良好，至样品采集时，处理组黄芪地上部分生长明显高于对照组，且叶片更加浓绿、茂盛。药效成分测定结果表明（表3）：与对照组相比，黄酮类的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量均显著升高(P<0.05)，分别提升40.5%和83.1%；毛蕊异黄酮和芒柄花素含量未发生明显变化；以上述4种成分的总量来看，总黄酮含量较对照显著升高(P<0.05)。皂苷类无论单一成分还是总量，与对照相比均有所升高，但差异不显著。总多糖含量未发生显著变化。由此可知，菌株R57发酵液施用可在一定程度上提升黄芪黄酮类活性成分的含量，但对皂苷和多糖无明显促进积累的作用。

表3 菌株R57发酵液施用对黄芪药效成分的影响

2.3 菌株R57的分类鉴定

2.3.1 形态学及生理生化特征 菌株R57在PDA平板上菌落呈圆形或椭圆形，米白色，不透明，表面中间褶皱，边缘锯齿状；菌体大小为(0.5～1.5)μm×(3.0～4.0)μm，革兰氏和芽孢染色均为阳性，芽孢通常在菌体中间。生理生化特性测定结果见表4。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定R57为枯草芽孢杆菌B.subtilis。

表4 菌株R57的生理生化特性

2.3.2 16S rDNA序列测定与分析 以菌株R57基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行扩增，测得R57 16S rDNA核苷酸序列长度为1460 bp。将该序列提交到GenBank（登录号：KX427025.1），并与数据库中的已知序列进行同源性比对；运用MEGA5.05建立系统发育树Test Neighbor-Joining Tree（图1）。结果表明，菌株R57与B.subtilis形成一个族群，同源性高达99%。综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA序列分析，最终将菌株R57鉴定为枯草芽孢杆菌B.subtilis。

图1 基于16S rDNA序列构建的菌株R57的系统发育树

3 讨论

芽孢杆菌具有抑菌谱广、抗逆性强、可分泌多种抗菌物质，且繁殖快、生产成本低、安全性高、种类繁多等优点，在植物病害的生物防治中占有重要地位[22]。同时，它还是植物健康和营养的天然资源[23]，产生的代谢物可促进植物生长发育，改善植物品质[24-25]，因此也被应用于农产品的增产提质中。研究获得的多功能菌株R57为枯草芽孢杆菌，该类细菌在改善土壤微生物群落结构，维持土壤养分供给和病虫害防治等方面功效明显；同时，枯草芽孢杆菌处理对促进植株生长，改善果实品质也有很好的效果[24]。菌株R57兼具了上述两项优点，在黄芪根腐病防治和活性成分含量提升方面均显示出了一定的应用潜力，但无论防病效果还是品质改善作用，都还需通过制剂形成、使用方法改进等措施进一步加以提高，才能满足在实际生产中应用的要求。研究表明，复合菌肥因其含有多种微生物而能够发挥更加丰富的功能，因此，加大研究力度以获得更多的功能菌株，并将其混配复合使用，可作为提高功能菌制剂整体效能的有效途径之一。

农业生态系统中，芽孢杆菌作为一类典型的植物根际有益细菌，通常以竞争作用、抗生作用、促进植物生长和诱导系统抗性等机制对病害起到防控作用[22]。对药用植物的有效成分，根际微生物则通过调控药用植物中与次生代谢产物合成相关基因的表达，合成转化植物活性成分前体的关键酶等机制促进其积累[26]。如短小芽孢杆菌B.pumilus通过增加关键酶的表达来提高甘草酸的含量[27]。另外，植物地上部产量的增加和品质的提高离不开根系对土壤中养分吸收的提升，根际有益微生物能通过矿化、硝化等过程活化土壤养分，提高土壤中速效养分（如有效氮、有效磷等）的含量[25]，促进植株体对这些养分的吸收利用。总之，“植物—有益微生物—土壤”之间存在着复杂的互作关系，这种关系的变化一方面影响植物土传病原对植物根系的入侵，另一方面也通过影响根际介质结构与肥力，间接影响作物生产过程，调控植物次级代谢产物的积累。因此，枯草芽孢杆菌R57灌根后，如何阻止根腐病菌侵染黄芪根部，如何调控或促进药效成分含量变化，进而达到“防病提质”的效果，将是下一步深入研究的方向。

在R57对根腐病防效试验中，我们发现预防性处理和治疗性处理下，离体与盆栽防病的效果间并不具有一致性，推测其原因一方面可能在于R57发挥作用的介质（水和土壤）不同，影响了抗菌物质效力的发挥；另一方面离体防病试验中去除了拮抗菌菌体，而盆栽试验用全发酵液进行灌根，也是造成防效波动的重要因素。此外，研究中仅测定了黄芪6种主要药效成分的变化，不足以全面反映R57处理对黄芪整体品质的影响，因此，借助以组群指标分析为基础的植物代谢组学技术探究其对黄芪活性成分的影响，是更为理想的品质变化评价手段。还需注意的是，黄芪中的皂苷80%以上分布在表皮，试验中样品粉碎前对黄芪表皮的处理可能导致了部分皂苷的损失，使得皂苷Ⅳ和皂苷Ⅰ的实际测定结果较其他文献的报道偏低。

4 结论

针对由F.solani和F.acuminatum侵染引起的黄芪根腐病，功能菌株R57发酵液的保护性防病效果分别为61.27%±4.89%和64.33%±8.25%；同时，该发酵液的施用还使黄芪中主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷的含量分别提升了40.5%和83.1%。经鉴定，菌株R57属枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。上述结果表明，枯草芽孢杆菌R57不仅具有抑菌防病的作用，而且还能促进黄芪主要药效成分的积累，改善品质。菌株R57的研究为黄芪专用多功能制剂的开发奠定了物质基础，其进一步开发利用可为解决当前黄芪规模化生产中根腐病发生严重和药效成分含量降低等问题提供思路和方法。