刘 瑞, 于文庚, 胡顺鑫, 尚 帅*

(1.滨州学院, 山东 滨州 256600；2.山东省海洋资源与环境研究院, 山东 烟台 264001)

植物叶际微生物群落中含有丰富的细菌、真菌和病毒，叶际微生物具有多种功能，如固氮[1-3]、促进植物生长[4-5]、抑制病原微生物[5]、降解环境污染物[6]等。植物叶际微生物群落的多样性、扩散性和群落发育与寄主植物的生理生化、生活环境和免疫力有关[7]。

白蜡(Fraxinuschinensis)作为重要的耐盐碱植物，雌雄异株，广泛分布于黄河三角洲区域，其树干挺拔直立，外形美观，树皮也可以作为药用，是重要的景观植物。然而在雌雄异株植物的研究进展中，对于白蜡雌雄株的叶际微生物菌群的研究很缺乏。漫长的进化历程导致雌雄植株在诸多方面表现出显著差异。因此，本研究分析白蜡雌雄植株微生物组成差异的影响因素，能够更好地了解雌雄株的适应特性与差异。

1 材料与方法

1.1 叶片采集

采样点位于黄河三角洲区域(北纬37°22′、东经118°02′)，该地区属于温带大陆性气候，全年平均气温12.9 ℃，年降水量632 mm，土地为盐碱地。分别取4棵不同的雌性(BC1～BX4)和雄性白蜡树(BX1～BC4)，选择枝叶繁盛，无病虫害，树龄3年以上的白蜡雌雄植株。树的性别根据有无种子辨别，采样时戴上无菌手套平均采摘(东南、西南、东北)枝干上的完整嫩绿的、无病虫害斑点的叶片共50～100 g。将摘取的样品放入无菌封口袋中，液氮保存，储存于-20 ℃冰箱中。

1.2 叶片微生物DNA提取及微生物分析

称取白蜡雌雄株叶片样品3 g，剪碎放入灭菌的锥形瓶中，加入1∶20(叶重/体积TE缓冲液=1∶20)无菌TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH为8.0)，用灭菌膜封口在室温条件下200 r/min的摇床上振荡30 min，分离微生物，振荡后的叶片在40 kHz超声15 min，在无菌环境中使用真空抽滤设备将振荡液中的微生物收集到0.22 μm的灭菌的滤膜上，使用试剂盒提取滤膜上的总DNA[7]。基于16S rDNA基因的V3～V4区，利用高通量测序仪对白蜡雌雄株样品的细菌进行测序。

2 结果和分析

2.1 样品稀释曲线

由图1可知，8个样本序列数目均在10 000之后趋于平缓，表明测序结果具有合理性，本研究所获取的测序数据真实可信。

图1 样品的稀疏曲线

2.2 白蜡雌雄叶际菌群alpha多样性分析

alpha多样性指数用来反映雌雄白蜡叶际微生物群落多样性，分别采用Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、Goods-coverage 5种指数来描述(表1)。雌雄白蜡alpha多样性的coverage指数均为1，说明测序质量较好，可以进行后续的多样性分析，雌株叶际细菌群落的observed-otus指数大于雄株细菌菌群；另外，雌株叶际细菌的Shannon指数(表示群落多样性，其数值与多样性成正比)明显高于雄株细菌菌群。结果表明，白蜡雌株叶际细菌菌群在物种数目和群落结构多样性上远高于白蜡雄株叶际细菌菌群。

表1 样本多样性指数

2.3 雌雄白蜡叶际菌群结构组成

通过韦恩图直观展示各分组特有及共有的otu数目，以此来分析雌雄白蜡样品间的相似性。由图2显示，白蜡雌株叶片特有otu为901个，白蜡雄株特有otu为680个，白蜡雌雄叶片共有otu为251个。雌雄白蜡叶际菌群组成存在差异，白蜡雌株叶际特有菌群多于白蜡雄株。

图2 雌雄白蜡叶际菌群韦恩图

由图3显示，白蜡叶际细菌属于13门，18纲，30目，40科，67属。在门水平上，白蜡雌株叶际优势菌群为蓝藻菌门(72.38%)，变形菌门(17.10%)，栖热菌门(4.57%)，放线菌门(2.53%)，拟杆菌门(2.07%)；白蜡雄株叶际优势菌群为蓝藻菌门(84.06%)，变形菌门(10.30%)，放线菌门(1.53%)，拟杆菌门(1.52%)，栖热菌门(1.38%)。

图3 雌雄白蜡叶际菌门组成

在属水平上，白蜡雌株叶际优势菌群为生氧光细菌、异常球菌属、鞘氨醇单胞菌、甲基杆菌属等；白蜡雄株的主要菌属为生氧光细菌、鞘氨醇单胞菌和薄层菌属等(图4)。

图4 雌雄白蜡叶际菌属组成

3 结论与讨论

叶际微生物广泛分布于各类植物中，影响植物的生长发育和代谢活动，植物为叶际微生物提供营养物质与生存空间，叶际微生物与植物相互影响，并处于动态平衡过程中。随着叶际微生物组研究的不断深入，植物与叶际微生物间的研究也越来越多。叶际环境作为特殊的生境，具有很大的不稳定性，存活于叶际的微生物面临水分匮乏、营养缺乏及强光、高温和紫外线的影响。本研究发现，白蜡雌雄株叶片虽然都具有一定数量的特有otu，但存在251个共有otu，表明白蜡雌雄株叶片既存在差异，又有共性。

相关研究发现，叶际优势菌群主要包括变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门[8-11]。本研究发现，白蜡叶际细菌中蓝藻菌门占优势，其次是变形菌门，放线菌门和拟杆菌门。蓝藻菌门可以通过氮气的固定来提高稻田和其他土壤的肥力，在水体进化中也起到积极的作用。因此叶片中的蓝藻菌门能够产生氧气，净化空气和固氮的作用，能够促进白蜡的生长。

白蜡雌雄株叶际微生物群落的多样性指数存在一定的差异，白蜡雌株菌群结构多样性高于白蜡雄株叶际菌群。此外，白蜡雌雄株叶际微生物在门水平差异不大，在属水平存在显著差异。通过比较白蜡雌雄株菌群发现，杀雄菌属(0.18%)为雌株特有，前人研究发现杀雄菌属共生菌广泛分布于节肢动物中，能够杀死寄主的雄性胚胎，具有改变白蜡虫后代雌雄比例的作用[12]，推测白蜡雌株叶片对于白蜡虫具有一定的防御能力。