罗荪琳, 范瑞祺,, 张婉君,, 贾 栗, 苑晓燕, 陈义强*,

(1. 中国农业大学 动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2. 中国人民解放军疾病预防控制中心，北京 100171)

氟氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯是两种常见的拟除虫菊酯类杀虫剂，因其高效、广谱、低毒的特性，已广泛用于农业生产虫害防治[1]。相较于多数传统农药，拟除虫菊酯类杀虫剂对哺乳动物毒性较低且效果好，因此在近几十年里已逐渐发展为使用率排前三的杀虫剂[2]，其典型代表氟氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯的使用量也大幅增加[3]。然而已有研究指出，包括氟氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯在内的拟除虫菊酯类农药对水生生物具有较高的毒性[2-4]。此外，这两种农药还具有可与水体中有机沉积物结合的特性[5]，结合近年来关于氟氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯在部分水域中高检出浓度的报道[6-7]，这两种农药的环境风险尤其是对水生生态系统的风险值得引起关注。

传统的环境风险评估方法往往仅评价农药对非靶标动物的半数致死浓度 (LC50)或者无可见有害作用水平/最小可见损害作用水平(NOAEL/LOAEL)，然而NOAEL/LOAEL 法得出的结果必然是试验中实际采用的浓度，因此其结果的准确性受限于试验设计[8]。针对这一局限性，基准剂量 (BMD) 法应运而生。BMD 法最早在1984 年由Crump[9]提出，其定义为依据动物试验所得的剂量-反应关系，用适合的统计学模型求得受试物引起某一特定水平生物效应的剂量，该生物效应被称为毒性基准效应(BMR)。一般用基准剂量值95%置信区间下限 (BMDL) 来推导动物或人类安全暴露水平的参考值 (POD)[10-11]。

斑马鱼因易于观察，且对环境污染物敏感，适合用于环境污染物的毒理学研究[12-13]。本研究以斑马鱼胚胎为模型，通过测定氟氯氰菊酯与高效氯氟氰菊酯暴露对斑马鱼胚胎自主运动和仔鱼心率、孵化率、死亡率及畸形率的影响，采用BMD法比较了两种药剂对斑马鱼的胚胎发育毒性差异，同时还比较了两种农药BMDL10值与LOAEL值的关系，以期对BMD 法在农药环境风险评估领域的应用前景进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器设备

氟氯氰菊酯 (cyfluthrin) 原药，纯度96.4%，Sigma-Aldrich 公司 (美国)；高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin) 原药，纯度99.1%，Dr.Ehrenstorfer 公司 (德国)；二甲基亚砜 (DMSO)，纯度99.7%，ThermoFischer 公司 (美国)；其他试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂公司。

SPX-250B-G 智能可编程光照培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；SZ-10 体视显微镜，日本Olympus 公司；acA1300-60gm 面阵相机，德国Basler 公司；视频采集软件Media Recorder 4.0和视频分析软件DanioScope 1.1，荷兰Noldus 公司。

1.2 斑马鱼的饲养及鱼卵收集

野生型Tu 系斑马鱼Danio rerio购自武汉斑马鱼资源中心，采用爱生科技的斑马鱼饲养系统，在封闭的斑马鱼房进行饲养。控制光照/黑暗周期为14 h/10 h，室温保持在 (28.5 ± 2.0) ℃，每日饲喂两次新鲜孵化的丰年虾Artemia salina幼虫。

在试验前一天下午选择性成熟的雌、雄鱼若干，按照两雌/两雄的比例放入繁殖盒中，用隔板隔开，于次日早晨光周期开始时抽开隔板，使雌雄鱼自由追逐交配，收集抽开隔板0.5 h 内受精的鱼卵。

1.3 斑马鱼胚胎的染毒暴露

准确称取两种供试农药，采用DMSO 溶解配制成储备液，再用Holt Buffer (含NaCl 3.5 g/L，KCl 0.05 g/L，CaCl20.1 g/L，NaHCO30.05 g/L) 稀释成对应浓度的暴露液，其中DMSO 的最终体积分数为0.1% (已证明此体积分数下不会引起显著的发育毒性)。参照De Perre 等[14]和Wang 等[15]的报道及预试验结果，最终确定处理液中氟氯氰菊酯的系列质量浓度为10.00、13.48、18.17、24.50、33.02、44.51 和60.00 μg/L，高效氯氟氰菊酯的系列质量浓度为1.00、2.15、4.64、10.00、21.55、46.42 及100.00 μg/L，同时以体积分数0.1% 的DMSO为溶剂对照组。将收集的受精后4 h 的卵置于体视显微镜 (6.3 × ) 下进行观察，剔除未受精、凝结及卵膜破损的卵。将斑马鱼卵置于六孔板中，每孔20 枚，孔中已预先加入10 mL 暴露液。每浓度3 个重复，每24 h 更换一次暴露液，同时剔除死亡卵，持续染毒96 h。于受精后96 h 时记录各组胚胎死亡率和畸形率，其中畸形指标包括脊柱弯曲、心包水肿及卵黄囊水肿。

1.4 发育指标检测

分别统计受精后24、48、72 及96 h 时斑马鱼胚胎的死亡率，死亡标志为卵凝结和心跳停滞；同时自受精后48 h 起每隔24 h 统计各组的畸形率，统计项目包括心包水肿、卵黄囊水肿和尾部畸形；并统计胚胎受精后48 h 的孵化率，孵化标准为仔鱼与卵膜完全分离。

于受精后24 h，每个处理选择5 个胚胎在体视显微镜下观察，使用Media Recorder 录制其1 min的自主摆动情况，并通过DanioScope 进行自主运动情况的分析和统计。在受精后48 h，同样每处理选择5 条仔鱼，使用相同方法进行30 s 心率的采集与分析。

1.5 数据分析及统计

使用Origin 8.0 软件 (OriginLab，美国) 对死亡率和畸形率进行统计，并计算LC50值和致畸作用EC50值。分别通过Shapiro-Wilk 检验和Levene检验验证胚胎发育指标方差的正态性和齐性。如果满足条件，则采用单因素方差分析并进行事后LSD检验；如果不满足条件，则使用Kruskal-Wallis 非参数检验并进行Bonferroni 事后检验(P＜0.05 为差异显著)。采用Benchmark Dose Software 3.2 软件(美国环保署，EPA) 分别计算基准剂量 (BMD10，benchmark dose of 10% response) 值及其置信区间下限(BMDL10，lower confidence limit of BMD10)值，选取拟合度最佳的模型作为BMD 曲线[16]。同时将试验中观察到的可引起指标明显变化的最小剂量定义为最小可见损害作用水平 (LOAEL，lowest observed adverse effect level)[17]。

2 结果与分析

2.1 氟氯氰菊酯对斑马鱼胚胎和仔鱼发育指标的影响

氟氯氰菊酯对斑马鱼仔鱼的受精后96 h LC50值为45.12 μg/L，对仔鱼的致畸作用EC50值为14.33 μg/L；致死和致畸作用的LOAEL 值分别为20.00 和13.48 μg/L。和溶剂对照组相比，尽管只有中等剂量 (18.17～44.51 μg/L) 的氟氯氰菊酯会引起胚胎受精后24 h 自主运动次数显著增加 (图1A)，但不同质量浓度 (10.00～60.00 μg/L) 氟氯氰菊酯暴露均能导致仔鱼受精后48 h 心率显著加快和孵化率显著升高 (图1B、1C)，44.51 μg/L 的氟氯氰菊酯会引起受精后48 h 仔鱼心包水肿、脊柱弯曲和卵黄囊水肿 (图2B)，而24.50 和13.48 μg/L 的氟氯氰菊酯则不会引起脊柱弯曲，其致畸作用主要表现为心包水肿和卵黄囊水肿 (图2C、2D)。

图1 氟氯氰菊酯对斑马鱼胚胎和仔鱼发育指标的影响Fig. 1 The effect of cyfluthrin on developmental parameters of zebrafish embryos and larvae

图2 氟氯氰菊酯对受精后48 h 仔鱼致畸作用的典型表现Fig. 2 Typical manifestations of teratogenic effects of cyfluthrin on 48 h post-fertilization larvae

2.2 高效氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎和仔鱼发育指标的影响

高效氯氟氰菊酯对斑马鱼仔鱼的受精后96 h LC50值为58.66 μg/L，对仔鱼的致畸作用EC50值为46.12 μg/L；致死和致畸作用的LOAEL 值分别为10.00 和46.42 μg/L。和溶剂对照组相比，尽管只有高剂量 (46.42～100.00 μg/L) 的高效氯氟氰菊酯会引起胚胎受精后24 h 自主运动次数显著增加 (图3A)，中高剂量 (21.55～100.00 μg/L) 下可使胚胎受精后48 h孵化率显著升高 (图3B)，但不同质量浓度 (1.00～100.00 μg/L) 高效氯氟氰菊酯暴露均能导致胚胎受精后48 h 心率显著加快 (图3C)。此外，与氟氯氰菊酯情况类似，高剂量 (46.42 μg/L) 下高效氯氟氰菊酯会引起受精后48 h 仔鱼心包水肿和卵黄囊水肿 (图4B)，而中低剂量 (2.15 和10.00 μg/L) 下则仅引起心包水肿 (图4C、4D)。

图3 高效氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎和仔鱼发育指标的影响Fig. 3 The effect of lambda-cyhalothrin on developmental parameters of zebrafish embryos and larvae

图4 高效氯氟氰菊酯对受精后48 h仔鱼致畸作用的典型表现Fig. 4 Typical manifestations of teratogenic effects of lambda-cyhalothrin on 48 h post-fertilization larvae

2.3 通过基准剂量法推算氟氯氰菊酯对斑马鱼发育指标的影响

氟氯氰菊酯对斑马鱼胚胎受精后96 h 死亡率、受精后96 h 畸形率、受精后48 h 心率、受精后24 h 自主运动和受精后48 h 孵化率的BMD10值分别为18.07、10.94、1.67、16.62 和10.39 μg/L，BMDL10值分别为14.56、10.75、1.17、14.54 和9.50 μg/L (表1)。由此推测受精后48 h 心率是斑马鱼胚胎暴露于氟氯氰菊酯的最敏感指标，其后依次为受精后48 h 孵化率、受精后96 h 畸形率、受精后24 h 自主运动和受精后96 h 死亡率。氟氯氰菊酯对斑马鱼胚胎发育毒性所有指标的BMDL10值均小于LOAEL 值，其中差值最大的是受精后24 h 胚胎自主运动指标，而差值最小的是受精后48 h孵化率。

表1 氟氯氰菊酯发育指标的基准剂量Table 1 BMD of developmental parameters after exposure to cyfluthrin

2.4 通过基准剂量法推算高效氯氟氰菊酯对斑马鱼发育指标的影响

高效氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎受精后96 h 死亡率、受精后96 h 畸形率、受精后48 h 心率、受精后24 h 自主运动和受精后48 h 孵化率的BMD10值分别为6.14、37.49、7.2、45.46 和6.32 μg/L，BMDL10值分别为4.83、24.74、5.17、44.15 和4.03 μg/L (表2)。由此推测受精后48 h 孵化率是斑马鱼胚胎暴露于高效氯氟氰菊酯的最敏感指标，受精后96 h 死亡率次之，其后依次为受精后48 h 心率、受精后96 h 畸形率和受精后24 h 自主运动。和氟氯氰菊酯最敏感指标 (受精后48 h 心率) 的BMDL10值相比，高效氯氟氰菊酯最敏感指标 (受精后48 h 孵化率) 的BMDL10值更低。此外，除受精后48 h 心率外，高效氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎发育毒性其他各项指标的BMDL10值均小于LOAEL 值。受精后48 h 的LOAEL 值小于BMDL10值，其原因可能是由于试验中所有剂量处理均可引起心率的变化，从而导致BMD 计算存在偏差。在剩下的4 项指标中，BMDL10与LOAEL 差值最大的是受精后96 h 畸形率，而差值最小的是受精后24 h 胚胎自主运动。

表2 高效氯氟氰菊酯发育指标的基准剂量Table 2 BMD10 of developmental parameters after exposure to lambda-cyhalothrin

3 结论与讨论

本研究采用基准剂量法，探究了氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯对斑马鱼的胚胎发育毒性，发现两种药剂对斑马鱼的5 个发育指标均有不同程度的毒性作用。通过BMD 推算氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯对斑马鱼发育毒性指标的敏感性，结果显示，这两种同属于Ⅱ型拟除虫菊酯类的杀虫剂对斑马鱼发育毒性的最敏感指标并不相同，其中氟氯氰菊酯的最敏感指标为受精后48 h 心率，高效氯氟氰菊酯的最敏感指标是受精后48 h 孵化率，且氟氯氰菊酯最敏感指标的BMDL10值要低于高效氯氟氰菊酯最敏感指标的BMDL10值，表明即使相同类别的不同药剂，其对斑马鱼的胚胎发育毒性仍可能存在差异。这种差异可能源自二者的理化性质特征[18-19]，或者其结合特定受体的能力不同[20-21]，也可能来自于二者的毒代动力学差异[22-23]。

相比较而言，除了高效氯氟氰菊酯处理组的48 h 心率外，两种药剂其他观测指标的BMDL10值均低于LOAEL 值，体现了BMD 法的优势。因为相较于NOAEL 或LOAEL 法，BMD 法可依据给定的样本量和剂量水平，进行多种数学模型的拟合，并从中选出最优模型，进而可从实验数据中挖掘到更多、更精准的信息[24]。并且，NOAEL或LOAEL 法判定的结果必然是实验设计中给定的一个剂量，实际的无作用剂量/最低水平剂量会小于NOAEL 或LOAEL 值，而BMD法可利用所有实验数据进行拟合判定，从而为制定安全暴露水平提供更准确可靠的结果[25]。此外，BMD 法计算的结果主要以95%置信区间的方式呈现，这也在一定程度上增加了其结果的可信度[16]。本研究不仅揭示了同属Ⅱ型拟除虫菊酯类的氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯在对斑马鱼胚胎的发育毒性上存在差异，还提示两种农药的大多数胚胎发育毒性指标的BMDL10值均低于LOAEL值，说明以BMDL10值作为参考，可能获得更低、更加保守的毒性阈值。

关于高效氯氟氰菊酯的48 h 心率BMDL10值高于LOAEL 值这一特殊情况，则表明BMD 法依然依赖于实验设计的准确性[26]，因此若出现类似这种所有试验剂量均引起某一指标显著变化的情况，则说明该BMD 法的拟合结果可能不够准确。这也说明在运用BMD 法评价化合物的毒性时，实验设计应该严格遵循毒理学实验的原则和BMD 法的相关指南，同时也表明BMD 法仍有待进一步完善，需要在实际应用的过程中不断发现问题并加以改进。

有关BMD 法在风险评估领域的应用优势，目前也有一些机构提出了较为全面的评估报告。例如欧洲食品安全局 (EFSA) 认为BMD 法相对于NOAEL 法更为准确[8]，美国环保署 (EPA)也已推荐使用BMD 法评估化合物的健康风险[27]，另外还有一些研究者尝试采用BMD 法评价化合物的环境风险[28-29]。然而目前我国尚未将BMD 法纳入农药环境风险评估标准或指南中。考虑到BMD 方法本身仍在不断完善，例如引入贝叶斯方法完善数学模型，引入多模型平均的概念[10]等，且BMD 评价方法正逐步受到认可，因此其在未来的农药环境风险评估当中应具有一定的应用前景。

综上所述，本研究结果显示，BMD 法不仅可用于比较同属于Ⅱ型拟除虫菊酯类的氟氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯在对斑马鱼胚胎发育毒性上的差异，还可以更好地挖掘实验数据，计算得到比传统LOAEL 法所得结果更低的毒性阈值，同时还能降低对试验剂量设计的依赖。因此，BMD 法在农药的环境风险评估方面具有广阔的应用前景，可为风险评估提供新的思路和策略，但其进一步的应用与推广仍有待深入研究和探索。