令利军，程文婷，蒋坤玲，王圆圆，罗 鸿，杨彩云，庞明梅，马稳霞

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

黄花蒿(ArtemisiaannuaLinn)是菊科蒿属一年生草本植物，其叶、嫩枝、花蕾含有多种药用成分，具有抗菌、抗寄生虫、解热以及增强免疫等作用[1]。通过水蒸气蒸馏法获得的黄花蒿精油(essential oil ofArtemisiaannua,ALEO)具有抗虫活性，对害虫体内支持生命的生物分子具有强抑制作用，同时具有较强的抗菌及抗氧化活性[2]。桉叶油醇(1,8-cineole)是黄花蒿精油的主要成分之一，具有抗炎和抗氧化作用[3]。

兰州百合是国家地理标志产品[4]，具有清肺功效，其鳞片中富含淀粉、蔗糖、氨基酸等重要营养成分，具有促进胃肠功能、降低血糖、调节血脂等作用，被誉为“蔬菜人参”[5]。百合在采摘、贮藏、运输等过程中容易受到机械损伤，致病菌从其肉质根或鳞茎上的伤口侵入，从而造成鳞茎褐变腐烂[6]。真菌感染是兰州百合在贮藏过程中安全性及感官特性改变、功能物质被破坏及产生异味的主要原因，导致食用价值下降[7-8]。目前，多种植物精油进入果蔬保鲜领域。 Louise等[9]研究发现，柠檬香茅(Cymbopogoncitratus(D.C) Stapf)精油通过抑制番石榴中不同炭疽菌的生长和繁殖抑制炭疽病发展，减少番石榴质量、硬度和颜色变化，并有助于提高感官参数的酶活性，延缓番石榴成熟，提升果实采后品质且延长货架期；猴面包树茎叶精油具有抑菌作用和保持番茄果实贮藏品质的潜力[10]；大蒜和迷迭香精油在实验室和温室条件下具有较好的杀菌效果，能显著降低草莓果实炭疽病的发病率和腐烂程度，并且保留了草莓果实的感官属性和品质参数[11]。已有研究表明蒿属植物精油具有广谱抑菌活性[12]，但关于蒿属植物精油用于兰州百合采后保鲜的研究尚未见报道。为此，本研究探讨了黄花蒿精油及其单体桉叶油醇(1,8-cineole)对兰州百合采后病原菌的抑菌作用，并检测其浓度对兰州百合采后病害的防治效果，测定最佳保鲜浓度的黄花蒿精油及其单体处理后对兰州百合主要品质指标及生理生化指标的影响，从而筛选出适宜兰州百合保鲜的剂量，以期为黄花蒿精油及其单体在兰州百合采后保鲜中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄花蒿(ArtemisiaannuaLinn)于2019年采自甘肃省兰州市(35°55′53″ N，102°54′04″ E，海拔2 200 m)，采用水蒸气蒸馏法提取黄花蒿精油，用正己烷萃取馏出物并收集精油，用无水硫酸钠干燥，密封于玻璃瓶中,置于4 ℃冰箱中保存备用。黄花蒿精油(纯度100%)及其单体桉叶油醇均用质量分数0.5%吐温-80稀释。

新鲜兰州百合由兰州市七里河区农业技术推广站提供，低温贮藏。

病原细菌摩加夫芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)MT434775(B-6)，病原真菌李氏木霉(Trichodermalixii)MT434003(F-2)、篮状菌(Talaromycestumuli)MT434005(F-3)、镰刀菌(Fusariumannulatum)MT434004(F-6)，前期研究发现以上病原菌皆为兰州百合采后病害的主要致病菌[13]，均由西北师范大学生命科学学院植物与微生物互作实验室提供。

1.2 仪器设备

BSC-1300ⅡA2 生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ULTRA Plus扫描电子显微镜，德国蔡司有限责任公司；U2800紫外分光光度计，上海昂拉仪器有限公司。

1.3 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇的抑菌活性

1.3.1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 采用倍比稀释法[14]测定黄花蒿精油及其单体的MIC及MBC。将活化至对数期的病原细菌B-6调节至106CFU/mL ，取500 μL菌悬液至500 μL黄花蒿精油及其单体桉叶油醇浓度分别为2.5，5，10，20 mL/L的LB液体培养基中，使得黄花蒿精油及其单体桉叶油醇最终浓度分别为1.25，2.5，5，10 mL/L，以等量无菌水为对照。确定无明显细菌增长的黄花蒿精油及其单体的最低浓度为MIC，此浓度下具有不可见(无浊度)的细菌生长。 确定初始接种细菌被全部杀死的黄花蒿精油及其单体的最低浓度为MBC。

1.3.2 毒力分析 采用熏蒸法[15]测定黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对3种病原真菌的毒力。用无菌打孔器取病原真菌菌饼置于新鲜的PDA固体培养基中央，将不同浓度 (0.02，0.06，0.10，0.14，0.18，0.22，0.28，0.34，0.40 和 0.46 mL/L)黄花蒿精油及不同浓度桉叶油醇(0.02，0.06，0.10，0.14，0.18，0.30，0.40 和 0.60 mL/L)分别添加到无菌滤纸片(d=6 mm)上，然后将无菌滤纸片置于玻璃皿盖子中央，以无菌水为对照，放置28 ℃恒温培养箱中培养48 h,采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。通过SPSS分析建立以药物浓度对数为自变量(y)，抑制率值为因变量(x)的毒力回归方程(y=ax+b)、相关系数、95%置信区间和EC50,并以EC50表示黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原真菌菌丝生长抑制作用的强弱。

抑菌率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100%。

1.4 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原菌细胞壁的影响

1.4.1 病原细菌 参考谢家仪等[16]的方法并稍作修改。离心收集活化的B-6菌种，用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)重悬，再用黄花蒿精油及桉叶油醇的MIC、MBC浓度处理菌体 4 h，将处理的菌悬液8 000 r/min离心5 min，弃上清，用质量分数2.5%的戊二醛固定4 h，PBS清洗3次,最后用乙醇(体积分数30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)梯度脱水，收集菌体于滤纸包中冷冻干燥，将干燥好的样品镀金镜检。以等量无菌水处理为对照。

1.4.2 病原真菌 用无菌打孔器取病原真菌F-2、F-3和F-6菌饼分别接种于无菌PDA培养基上，用EC50浓度的黄花蒿精油及桉叶油醇分别处理病原真菌，以等量无菌水为对照。黄花蒿精油对病原真菌F-2、F-3和F-6的EC50分别为0.314，0.336，0.357 mL/L，桉叶油醇对病原真菌F-2、F-3和F-6的EC50分别为0.280，0.289，0.420 mL/L。将不同浓度的黄花蒿精油及桉叶油醇分别添加到无菌滤纸片(d=6 mm)上，然后将滤纸片置于培养皿盖子中央，置于28 ℃恒温培养箱中培养至长出菌丝，用无菌手术刀切取菌落边缘的菌丝，置于质量分数2.5%的戊二醛中固定过夜，0.2 mol/L PBS(pH 7.2)冲洗2次后，用乙醇(体积分数30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)梯度脱水，每个梯度脱水 15 min，冷冻干燥好的样品镀金镜检[17]。

1.5 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对兰州百合采后病害的防治

取新鲜兰州百合鳞片，自来水冲洗后用体积分数70%乙醇表面消毒20～30 s，无菌水洗涤2～3次，用无菌手术刀将百合切成1.5 cm×1.5 cm的小块，并用手术刀致伤，每个伤点加10 μL(106CFU/mL)病原细菌悬浮液或病原真菌孢子悬浮液，置于直径90 mm培养皿中。以致伤只加病原菌为对照，将15.38， 30.77， 46.15和61.53 μL/L的黄花蒿精油及其单体桉叶油醇吸附至直径6 mm无菌滤纸片上，将滤纸片置于培养皿盖子中央，密封后在25 ℃保持9 d，拍照并用image J软件计算病斑面积，筛选黄花蒿精油及其单体桉叶油醇的最佳保鲜浓度。

1.6 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对兰州百合采后生理生化指标的影响

兰州百合处理同1.5节，以病原真菌F-6为防治对象对兰州百合进行接种处理，试验组培养皿中分别加入15.38 μL/L的黄花蒿精油和桉叶油醇，对照组(CK)加入清水处理。密封后在25 ℃保持9 d，分别在保持0，3，6和9 d时测定兰州百合的品质指标及生理生化指标。

1.6.1 自由基清除率和褐变度 兰州百合褐变度测定参考程双[18]的方法，其褐变度以10×OD420表示。取500 μL兰州百合上清液与2 mL 60 μmmol/L DPPH乙醇溶液混合，避光室温放置30 min后，在517 nm处测量样品的吸光度值，以DPPH乙醇溶液为阴性对照，计算DPPH清除率。试验重复3次。

自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0为DPPH乙醇溶液的吸光度值，A1为样品溶液的吸光度值。

1.6.2 总酚和类黄酮含量测定 总酚和类黄酮含量测定参考Chen等[19]的方法，总酚含量以10×OD280表示，类黄酮含量以10×OD325表示。

1.6.3 可溶性糖含量测定 可溶性糖含量测定采用蒽酮硫酸法[18]。

1.6.4 丙二醛(MDA)含量测定 MDA含量测定参考文献[20]的方法并稍作修改：将兰州百合分别用15.38 μL/L的黄花蒿精油和桉叶油醇处理3 d，取兰州百合鳞片1.0 g，加入10%三氯乙酸(TCA)5 mL匀浆，10 000g离心30 min,得到5 mL提取液。取2 mL提取液添加到2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)中，在沸水中煮沸20 min，冷却至室温后吸取0.6 mL在450，532和600 nm处测其吸光度值。根据以下公式计算MDA含量。

c(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450；

MDA含量(μmol/g)=(c×V)/(Vs×m×1 000)。

式中：c为兰州百合组织提取液中MDA浓度，μmol/L；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所需样品提取液的体积,mL；m为样品质量，g。

1.6.5 保护酶活性测定 取5 g兰州百合鳞片至5 mL提取缓冲液中，4 ℃、12 000g离心30 min，收集上清液用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性。SOD活性测定参考文献[21]的方法，POD和PPO活性测定采用Habibi等[22]的方法。

1.7 数据处理

采用Excel统计试验数据，采用SPSS 20.0软件分析试验数据，采用Origin 2018绘图，采用Duncan’s检验差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇的抑菌活性

2.1.1 对病原细菌的MIC及MBC 采用倍比稀释法测定黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原细菌摩加夫芽孢杆菌MT434775(B-6)的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，结果表明，黄花蒿精油和桉叶油醇对B-6的MIC值均为1.25 mL/L,MBC值分别为1.25和5.00 mL/L，说明黄花蒿精油对B-6的抑菌作用较桉叶油醇强。

2.1.2 对病原真菌的毒力 采用熏蒸法测定黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对3种供试病原真菌的抑菌作用，通过SPSS 20.0软件分析其对3种病原真菌的毒力大小，结果如表1所示。由表1可知，黄花蒿精油对F-2、F-3、F-6的EC50分别为0.314，0.336和0.357 mL/L，桉叶油醇对 F-2、F-3、F-6的EC50分别为0.280，0.289和0.420 mL/L，表明桉叶油醇对兰州百合病原真菌F-2和F-3具有较好的抑菌效果，黄花蒿精油对F-6的抑菌效果较好。

表1 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原真菌的毒力

2.2 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原菌细胞壁的影响

2.2.1 对病原细菌细胞壁的影响 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原细菌B-6细胞壁的影响如图1所示。由图1可知，对照处理病原细菌B-6细胞菌体完整，呈典型的杆状，表面光洁平整，无菌体内容物外渗。用MIC、MBC浓度的黄花蒿精油和桉叶油醇处理4 h后，病原细菌B-6单个菌体不再完整，大量菌体出现堆积，表面出现褶皱，内容物渗出，细胞无充盈感，菌体拉长甚至断裂；黄花蒿精油和桉叶油醇浓度越大，对细菌细胞壁影响越大。

CK.对照处理；MIC.最小抑菌浓度处理；MBC.最小杀菌浓度处理

2.2.2 对病原真菌细胞壁的影响 通过扫描电镜观察黄花蒿精油及其单体桉叶油醇处理后病原真菌菌丝形态的变化，结果如图2所示。

图2 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对病原真菌细胞壁的影响(×3 000)

由图2可以看出，对照组病原真菌菌丝为均匀而规则的管状；将病原真菌接种后暴露于黄花蒿精油和桉叶油醇的EC50浓度中，菌丝表面出现大量褶皱、断裂、扭曲、末端膨大，菌丝变粗呈不规则状，大量出芽产生孢子，其中桉叶油醇处理病原真菌菌体皱缩更明显。

2.3 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对兰州百合采后病害的防治

由表2可知，接种病原菌后试验组与对照组兰州百合鳞片上的病斑面积差异显著。不同致病菌对黄花蒿精油的敏感程度不同，将试验组兰州百合鳞片上病斑面积显著小于对照组的最小浓度定义为最佳防治浓度，病原细菌B-6对黄花蒿精油最为敏感。当黄花蒿精油浓度为15.38 μL/L时，试验组兰州百合病斑面积显著小于对照组，表明黄花蒿精油对兰州百合的最佳防治浓度为15.38 μL/L。

表2 黄花蒿精油对兰州百合病斑面积的影响

由表3 可知，对照组兰州百合接种病原菌后快速发生腐败，病斑面积显著大于试验组，表明桉叶油醇能够有效降低病原菌在兰州百合体内的生长速率，减缓兰州百合腐烂。此外，桉叶油醇对兰州百合采后病原菌的体内防治具有剂量依赖性，随着桉叶油醇浓度增大，病斑面积逐渐减小。当桉叶油醇浓度为15.38 μL/L时，试验组兰州百合病斑面积显著小于对照组，表明桉叶油醇对兰州百合的最佳防治浓度为15.38 μL/L。

表3 桉叶油醇对兰州百合病斑面积的影响

2.4 黄花蒿精油及其单体桉叶油醇对F-6侵染后兰州百合生理生化指标的影响

2.4.1 DPPH自由基清除率和褐变度 由图3可知，兰州百合DPPH自由基清除率随处理时间延长逐渐降低，接种F-6后对照组兰州百合鳞片DPPH自由基清除率快速降低，其降低速率高于试验组，说明黄花蒿精油和桉叶油醇能够抑制兰州百合自身抗氧化活性的降低，从而提高兰州百合的抗逆性。

褐变直接影响兰州百合的感官色泽，通过测定褐变过程中产生的可溶性色素含量确定其褐变度。由图3可知，同一贮藏时间接种F-6后，对照组兰州百合的褐变度显著高于黄花蒿精油和桉叶油醇的试验组，表明黄花蒿精油和桉叶油醇能够有效抑制兰州百合鳞片中可溶性色素物质的生成，使褐变速率减慢，保留其本身色泽，从而延长其贮藏期。

图中不同小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)。下同

2.4.2 总酚和类黄酮含量 兰州百合鳞片中总酚和类黄酮含量的变化如图4所示。由图4可以看出，兰州百合鳞片中总酚和类黄酮含量随贮藏时间的延长而降低，且在贮藏第3～9天时，对照组兰州百合鳞片中的总酚和类黄酮含量均显著低于黄花蒿精油和桉叶油醇试验组。

图4 黄花蒿精油及桉叶油醇对兰州百合总酚和类黄酮含量的影响

2.4.3 可溶性糖含量 果蔬中可溶性糖含量的多少与其品质、成熟度及贮藏期密切相关。由图5可知, 兰州百合鳞片中可溶性糖含量随贮藏时间的延长而降低，且在贮藏第3～9天时，对照组兰州百合鳞片中的可溶性糖含量均显著低于黄花蒿精油和桉叶油醇试验组。

图5 黄花蒿精油及桉叶油醇对兰州百合可溶性糖含量的影响

2.4.4 MDA含量 MDA是膜不饱和脂肪酸过氧化的次要终产物，其可以与蛋白质和核酸等大分子发生反应，改变其构型或使之产生交联反应，从而丧失生物功能；此外，MDA还会导致纤维素分子间的桥键松弛，因此MDA积累会对果蔬的细胞壁膜及细胞器造成一定伤害，已被用于果实发育过程中膜伤害的直接指示物。由图6可知，对照组兰州百合鳞片中MDA含量显著高于黄花蒿精油处理组，表明病原菌侵染后会加剧兰州百合鳞片中MDA含量积累，而黄花蒿精油能够抑制MDA含量增加，从而延长兰州百合贮藏期。

图柱上不同小写字母表示不同处理差异显著(P<0.05)

2.4.5 保护酶活性 SOD广泛存在于动植物及微生物体内，不仅可以清除超氧自由基，还能够与过氧化氢酶(CAT)及POD协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对动植物及微生物细胞膜系统的伤害，从而减少有机体中自由基的毒害作用。因此，SOD在诱导植物抗逆性方面发挥着重要作用。由图7可知，不同处理组兰州百合鳞片SOD活性均随着处理时间延长逐渐增加，且黄花蒿精油处理组显著高于对照组。

图7 黄花蒿精油及桉叶油醇对兰州百合SOD活性的影响

PPO和POD是果蔬体内普遍存在的重要氧化还原酶，与果蔬的生理生化过程密切相关，能够促进酚类物质生成颜色较深的醌类物质，导致果蔬发生酶促褐变。兰州百合鳞片中PPO和POD活性如图8所示。由图8可知，病原菌侵染后，兰州百合鳞片POD和PPO活性均急剧升高，处理第6天后对照组兰州百合鳞片POD和PPO活性均显著高于试验组，且第 6天后对照组兰州百合POD活性急剧降低。POD和PPO活性与兰州百合鳞片褐变结果一致。表明黄花蒿精油及桉叶油醇能够有效抑制兰州百合鳞片POD和PPO活性，从而抑制其体内总酚类物质被氧化，降低了兰州百合鳞片的褐变度，延长贮藏期。

图8 黄花蒿精油及桉叶油醇对兰州百合PPO和POD活性的影响

2.4.6 不同生理生化指标间的相关性 病原菌侵染后兰州百合的褐变度与总酚、类黄酮含量以及PPO和POD活性相关性结果如表4所示。由表4可知，兰州百合的褐变度与其体内总酚含量呈显著负相关(P<0.05)，与PPO活性呈极显著正相关(P<0.01)；兰州百合鳞片中总酚含量与PPO活性呈极显著负相关(P<0.01)。表明病原菌侵染后兰州百合褐变可能是由于，PPO活性迅速增加使酚类物质氧化形成棕色聚合物，进而导致兰州百合颜色加深。

表4 兰州百合褐变度与总酚、类黄酮、POD和PPO的相关性

3 讨 论

本研究结果表明，黄花蒿精油和桉叶油醇均具有良好的抑菌效果，且对不同病原菌的敏感度不同。研究发现黄花蒿精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、产黄青霉具有良好的抑菌活性[23-24]。桉叶油醇对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等多种病原细菌和腐败生物具有较强的抗菌作用[25-26]。从扫描电镜结果可知，黄花蒿精油及其单体桉叶油醇主要是通过破坏病原菌菌体细胞壁的完整性，导致细胞内容物渗出，进而引起细胞死亡，这与Oliveira等[27]的结果一致。黄花蒿精油的主要成分是萜烯类化合物，因其具有疏水性可以聚集在细胞膜上，改变膜的通透性，使细胞内容物泄露，从而导致细胞死亡[13,28]。 体内抑菌试验结果表明，黄花蒿精油及其单体桉叶油醇的浓度为15.38 μL/L时，兰州百合的病斑面积显著低于对照组，并且桉叶油醇对病原真菌的抑菌活性比黄花蒿精油强，这可能是黄花蒿精油中萜类化合物破坏了兰州百合部分细胞壁，促进了病原真菌在其鳞片中的生长[29]。

生理生化试验结果表明，黄花蒿精油及其单体桉叶油醇减缓了兰州百合鳞片中可溶性糖含量的降低，这与Chen等[19]的研究中ATP对采后龙眼果实的相关指标变化趋势一致，说明黄花蒿精油及其单体桉叶油醇能够保持兰州百合原有的风味并延长其贮藏期。黄花蒿精油和桉叶油醇处理后兰州百合鳞片中MDA含量较低，可能是由于处理后激活防御相关酶的诱导效应。因此，根据本试验研究结果和前人的研究[30]表明，精油及其单体可以通过控制膜脂过氧化来减轻兰州百合或其他果蔬作物中真菌侵染导致的腐烂。研究发现，抗氧化酶在增强兰州百合抗逆性、延缓衰老方面起着重要的调节作用[21]。在接种病原菌后，兰州百合鳞片中SOD活性随着接种时间的延长呈上升趋势，表明SOD在兰州百合抗逆性中起主要作用。此外，黄花蒿精油及桉叶油醇处理兰州百合鳞片后，抑制了DPPH自由基清除活性的降低。推测黄花蒿精油和桉叶油醇能够增加被病原菌侵染后兰州百合体内的次生代谢产物，从而增强果实的抗逆性，延缓衰老。果蔬的表观色泽是评价果蔬品质的最重要指标，与果蔬的表观品质和商业价值密切相关。POD是苯丙烷类代谢途径中诱导合成的关键酶，而PPO在植物体内的活性氧代谢中起着重要作用，并将酚类化合物氧化成有毒的醌类化合物来抑制病原菌的生长[30]。本研究中，通过对病原菌侵染后兰州百合的褐变度、总酚、类黄酮含量以及PPO和POD活性进行相关性分析可知，兰州百合的褐变主要是，受到外界环境胁迫时兰州百合鳞片中PPO活性增加，催化体内总酚类物质生成醌类等有毒的深色物质，使兰州百合表面颜色加深，这与Chen等[19]的研究结果一致。综上，黄花蒿精油及桉叶油醇处理兰州百合后抑制了病原菌在兰州百合体内的生长与繁殖，并且诱导了其体内防御相关酶活性的增加，降低了氧化损伤，延长了兰州百合的贮藏期。