张莉婷 乔娜娜

(1.子长市人民医院，陕西 延安 717300；2.延安大学咸阳医院，陕西 咸阳 712000)

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是中老年较常见、起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，仅次于心脑血管疾病和肿瘤，严重威胁着老年人生命健康[1]。该病临床上以记忆障碍、失语、视空间技能损害、执行功能障碍及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆[2]。研究发现，在AD晚期，患者的炎症反应会加速病变机制和神经细胞的凋亡，用抗炎药物能降低AD的病例程度。脑血管转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)在脑组织损伤中起重要作用，其表达量在AD患者的脑中显著升高，这是一种多功能蛋白家族，可调节细胞生长、分化并参与组织的重塑和炎症，具有保护细胞和对抗神经元损伤的作用[3-4]。TGF-β能诱导脑血管淀粉样变性并导致AD中微血管病变，微血管内皮细胞是细胞因子和趋化因子的来源，且易受刺激释放炎性因子，如白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α[5]。本研究拟观察AD微血管系统中TGF-β的表达量是否异常及TGF-β的表达量与IL-1β、TNF-α血管生产的关系，以期为临床AD的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1临床资料及微血管分离 选取2018年6月至2020年6月我院康复中心收治后死亡的78例AD患者为研究对象(AD组)，另选无AD神经病理特征且年龄与AD组匹配的非AD患者78例为对照(非AD组)。于AD患者死后4～15 h内切取其脑组织并置于-70℃备用，非AD组操作与AD组一致。所有研究经患者及其家属签署了知情同意书，并且经我院伦理委员会通过。用210 μm筛网过滤并在53 μm筛网上收集脑组织，在收集的颞叶、顶叶等皮质层中分离微血管，期间需经数次筛选和洗涤，直至检测不到细胞或蛋白质为止。制备微血管，用显微镜监测其纯度。将微血管悬浮于含10%胎牛血清和10%二甲基亚砜的培养基中培养，随后将其置于液氮中冷冻备用。

1.2条件培养基和裂解液的制备 于液氮中取出微血管并置于37℃水域中快速解冻，用2 000 r/min离心15 min，用4℃的Hanks缓冲液洗涤3次，后重悬于含1%乳清蛋白氢化酶的无血清DMEM中。将1 mL的微血管溶液(50 μg/样品)于37℃下在95% CO2/5% O2培养箱中培养4～6 h，后2 000 r/min离心15 min。使用裂解液(含0.5 mol/L乙二胺四乙醇和2%十二烷基硫酸钠SDS)裂解微血管后，用Western blot测定裂解物种TGF-β的含量；从内皮细胞、平滑肌细胞培养物中收集微血管内皮细胞，并置于含0.1%牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液中孵育，后添加不同溶度的TGF-β(0.01 μg/mL、0.03 μg/mL和0.06 μg/mL)培养24 h。非AD组细胞仅在培养基中孵育。用ELISA试剂盒测定上清中的IL-1β和TNF-α的表达水平。洗涤内皮细胞并用裂解液裂解样品，用Western blot测定IL-1β和TNF-α的含量。

1.3ELISA检测 采用购自R&Dsystems的ELISA试剂盒检测所有样品的TGF-β表达水平，用购自Boehringer Mannheim公司的ELISA试剂盒检测所有样品的IL-1β和TNF-α表达水平。TGF-β试剂盒的检测范围为31.2～2 000 pg/mL，IL-1β、TNF-α试剂盒的测量范围为5～700 pg/mL。

1.4蛋白印迹法检测 将微血管(50 μg/孔)和内皮细胞(20 μg/孔)裂解物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，把凝胶转移至硝酸纤维素膜上，用洗涤液洗涤两次后，常温下加5%脱脂奶粉进行封闭90 min，加入一抗(TGF-β、IL-1β、TNF-α)4℃孵育过夜，加入二抗后再孵育90 min，用化学发光法显色，胶片经凝胶成像系统扫描成像。

2 结 果

2.1微血管TGF-β表达水平 AD组和非AD组的微血管TGF-β表达水平分别为(28.45±7.26)pg/mL和(20.09±5.53)pg/mL(t=8.09，P<0.05)；相关的Western blot结果显示，AD组的衍生血管中TGF-β表达，而非AD组中未检测到TGF-β表达。见图1。

图1 两组患者的脑中微血管培养上清液中TGF-β表达水平

2.2不同浓度TGF-β处理后内皮细胞释放的IL-1β、TNF-α表达水平 非AD中，IL-1β、TNF-α的含量较低，随着TGF-β浓度的增加，IL-1β、TNF-α表达水平均显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度TGF-β处理后内皮细胞释放的IL-1β、TNF-α表达水平

2.3Western blot分析不同浓度TGF-β处理脑内皮细胞中IL-1β、TNF-α表达水平 Western blot分析结果显示，非AD组IL-1β、TNF-α的含量较低。脑内皮细胞与不同浓度TGF-β的孵育促使IL-1β、TNF-α的表达量随TGF-β浓度的升高而显著增加(P<0.05)。见表2、图2。

表2 不同浓度TGF-β处理脑内皮细胞中IL-1β、TNF-α表达水平

图2 不同浓度TGF-β下内皮细胞中IL-1β、TNF-α表达水平(泳道2～4、6～8)

3 讨 论

在AD的发病机制中，促炎和抗炎细胞因子是重要组成部分，其中中枢神经系统中TGF-β的增加是诱导AD发病的重要因素。对于AD患者，其主要的病理特征有老年斑(SP)，SP的主要成分是β淀粉样蛋白(Aβ)，它的聚集和沉淀是AD发表的重要机理，且Aβ被认为是强的活性促炎因子，通过级联反应直接参与脑内的炎症过程[6-7]。而TGF-β能引发AD患者的脑血管淀粉样病变和微血管变性结果也验证了TGF-β在AD病理中的重要作用。TGF-β还可通过炎性介质的相互作用促进AD脑中的血管和神经元病变，几乎所有的AD研究中的细胞因子和趋化因子均升高，证实炎性因子在AD患者的脑中尤为重要，但尚不清楚其具体机制[1,8]。

本研究结果显示，TGF-β的含量在微血管中显著升高(P<0.05)，并且刺激了脑内皮细胞释放大量的细胞因子IL-1β、TNF-α，且随着TGF-β的浓度升高，IL-1β、TNF-α的含量也相应的显著升高(P<0.05)，这揭示TGF-β是控制、诱导炎性介质的关键因素。参与AD患者脑内炎性反应的细胞主要是脑内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，这些细胞均会产生TGF-β，进而释放炎性蛋白[8]。有研究[7,9]报道，在小鼠的星形胶质细胞中产生过量的TGF-β，就能在其微血管中观察到脑血管淀粉样病变、膜蛋白的积累和退行性改变，且在转基因小鼠中广泛表达TGF-β，但在血管组织周围聚集最多在老年转基因小鼠的脑血管中，星形胶质细胞会促使产生TGF-β并诱导淀粉样蛋白β的分泌，而TGF-β可能是由脑内皮细胞星形细胞衍生的蛋白质。IL-1β能通过维持自身的级联放大效应而使炎性反应聚集于脑部，最终引起神经细胞的大量凋亡。TNF-α作为典型的炎性指标，其含量升高能对机体早上广泛性的损伤，同时能激活患者的核酸内切酶，进而损伤机体的内皮细胞，破坏微循环[10]。

综上所述，TGF-β在AD微血管中升高并刺激从脑内皮细胞释放促炎性因子IL-1β、TNF-α，表明血管衍生的TGF-β可以启动或增加破坏炎症循环的程度，促成神经元细胞死亡并提示这可能是AD中的治疗靶标。