朱文娟，黎丽敏，李锦妹，陈文静（. 惠州市食品药品检验所，广东 惠州 56003；. 嘉应学院医学院，广东梅州 5403）

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb．）Breit.的干燥块茎，有降逆止呕、镇咳祛痰、抗溃疡、抗血栓、抗肿瘤、抗氧化、抗癫痫、助眠和糖皮质激素样等作用[1-4]。在抗击新型冠状病毒肺炎（COVID-19）时，中药汤剂发挥着重要的作用，其中清肺排毒汤因其良好的治疗作用备受推崇，而半夏为其组方药之一[5]。半夏为临床常用的中药，但生品有毒，故不作内服。通过炮制降低半夏毒性、增强其药效，有利于临床应用和储存。常见的半夏炮制品有法半夏、姜半夏和清半夏，均收载于《中国药典》2020年版一部中药饮片部分。饮片的炮制方法为煎煮、浸泡、晾干等。法半夏炮制过程中需加入甘草和生石灰，姜半夏需加入白矾和生姜，清半夏需加入白矾[6]。半夏和甘草没有明显的抑菌性[7]；生姜对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有强烈的抑制作用[8]；白矾对白假丝酵母菌、大肠埃希菌和枯草杆菌有明显的抑制作用[9]。3 种半夏在炮制过程中使用不同的辅料，推测其抑菌性可能会有不同，因而其微生物限度方法适用性实验有差异。

2020年版《中国药典》仅对中药提取物、直接口服及泡服饮片进行了微生物限度规定，提出了耐热菌总数的概念和检测方法，但没有对其限值进行统一规定，其他类型的中药饮片也没有微生物限度控制的规定，且缺乏针对不同品种饮片的微生物限度检查法。中药来源主要分为植物、动物和矿物三大类，大多数中药饮片炮制过程简单，经过净选、洗润、干燥等过程，所携带的微生物有所降低，但仍有不同程度的附着和残留，若存放不当，在适宜的温度和湿度下，微生物很容易生长繁殖[10]。在污染严重的情况下，其附带的有害微生物、代谢毒素等，即使经过生产加工仍无法去除，进入终产品后将或多或少给患者带来风险[11]。

近年来，中药饮片的微生物污染情况受到越来越多的关注，张平等[10]对50 种中药煎煮类饮片微生物污染情况进行了初步探索，范一灵等[12]也对上海地区10 种中药饮片微生物情况进行研究，结果发现需氧菌总数（TAMC）最高值可达107～108cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数（TYMC）最高值可达105～107cfu·g-1，耐热菌检出率高达50%，60 种需煎煮类中药饮片，炮制方法为煮制类、炒制类和蒸制类的只占22%，切制、净制、敲制等占78%。切制、净制、敲制等炮制方式并不能降低中药饮片中的微生物数量，反而可能因为加工过程受到微生物的二次污染，因此，目前国内研究大多聚焦在此类中药饮片。而蒸、煮、炒制类的中药饮片微生物限度检查法和污染情况研究较少，本文选择半夏的3 种不同炮制品，炮制方式为加辅料煮制，同时建立3 种半夏的微生物限度检查法并对购自全国11 家企业32 批半夏饮片进行微生物污染调查，数据更有代表性和可比性，在初步探明半夏饮片的微生物危害因子的基础上，为中药饮片微生物污染风险评估、蒸煮类炮制方式的中药饮片微生物限度标准的制订和完善提供数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS-1600Ⅱ级生物安全柜（苏州安泰），BSP-400 生化培养箱（上海博讯），BMJ-400C 霉菌培养箱（上海博讯），VITEK 2 Compact 30 全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃），Stemi 508 显微镜（德国蔡司）。

1.2 中药饮片

法半夏13 批、姜半夏12 批、清半夏7 批购自11 家企业，均由笔者按《中国药典》2020年版各药材项下相关要求进行鉴定。

1.3 培养基

胰酪大豆胨肉汤培养基（TSB）、麦康凯液体培养基（MCB）（批号分别为1080935、K1459Y，广东环凯生物科技有限公司）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、麦康凯琼脂培养基（MCA）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）（批号分别为20011411、19121261、2004282、18062761、190627，北京陆桥技术股份有限公司）；肠道菌增菌液体培养基（EEB）、RV沙门菌增菌液体培养基（批号分别为20201128、20210108，北京奥博星生物技术有限公司），培养基适用性检查均符合要求[13]。

1.4 试剂

VITEK 2 革兰氏阴性鉴定卡、革兰氏阳性鉴定卡、芽孢杆菌鉴定卡（批号分别为2411302103、2421137403、2391523503，生物梅里埃美国股份有限公司）。

1.5 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白假丝酵母菌（Candida albicans）[CMCC（B）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，定量菌株（100 ～1000 cfu/100 μL）；乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi）[CMCC（B）50094]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，定量菌株（10 ～100 cfu/100 μL）；所有菌种均购于杭州微球科技有限公司，经菌种确认验收合格。

2 方法

按2020年版《中国药典》四部中药饮片微生物限度检查项下的相关要求，先进行方法适用性实验，以符合要求的稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查。耐热菌及控制菌检查中划线分离到的菌株用 VITEK 2 进行鉴定。

2.1 菌液制备

取复溶溶液1.1 mL，加入菌种冻干西林瓶中，充分混匀，即得方法适用性实验所需浓度的菌液。

2.2 供试液制备

取25 g 样品，加入225 mL TSB 中，振荡15 min，取其1∶10 的清液为供试液。

2.3 方法适用性实验

法半夏：选取亳州市中药饮片厂（批号：200701）、北京仟草中药饮片有限公司（批号：D200601001）、北京本草方源药业集团有限公司（批号：20200521）各1 批样品。

姜半夏：选取亳州市中药饮片厂（批号：200202）、北京仟草中药饮片有限公司（批号：D191116001）、北京本草方源药业集团有限公司（批号：20200701）各1 批样品。

清半夏：北京仟草中药饮片有限公司（批号：D200103001）、北京本草方源药业集团有限公司（批号：20200127）、郑州瑞龙制药股份有限公司（批号：18020401）各1 批样品。

中药饮片中微生物数量相对较高[12]，为避免影响微生物回收结果，先对上述样品各称取25 g后，进行115℃、20 min 灭菌，再进行方法适用性实验。

2.4 微生物的计数

取供试液及2 个连续10 倍稀释级，分别于TSA和SDA 中培养，TSA 置32.5℃下培养5 d，SDA 置22.5℃下培养7 d，分别计数平皿需氧菌落数。

取供试液10 mL 经沸水浴30 min 处理后迅速冷却，后续实验步骤和培养条件同TAMC 计数实验，测定耐热菌总数。将耐热菌进一步分离纯化，采用 VITEK 2 进行菌株鉴定。

2.5 控制菌的检查

2.5.1 耐胆盐革兰氏阴性菌 取供试液，于25℃下预培养2 h，取相当于0.1、0.01、0.001 g 样品的供试品溶液加入至10 mL EEB 中，按药典要求进行实验和培养，并查表得出定量结果[13]。

2.5.2 大肠埃希菌 取供试液10 mL，加至100 mL TSB 中，混匀，按药典要求进行实验和培养[13]，若MCA 平板上有菌落生长，挑取单菌落接种至TSA 平板，32.5 ℃下培养24 h 后，采用VITEK 2 进行菌株鉴定。

2.5.3 沙门菌 取10 g 供试品，加入100 mL TSB 中，混匀，按药典要求进行实验和培养[13]，若XLD 平板上有菌落生长，挑取单菌落接种至TSA 平板，32.5 ℃下培养24 h 后，采用VITEK 2进行菌株鉴定。

3 结果

3.1 微生物限度检查法的建立

采用常规平皿法，在供试液浓度为1∶10 时，3 种饮片的各菌回收比值均为0.5 ～2.0，结果见表1；控制菌检查中，均能检出实验菌。3 种半夏均无抑菌性，可用常规法进行检验。

表1 半夏炮制饮片微生物限度方法适用性实验结果Tab 1 Applicability test for microbial limit test of Pinelliae rhizome

3.2 微生物限度检查结果

3.2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌、耐热菌数测定32 批样品的需氧菌、霉菌和酵母菌计数结果介于10 ～105cfu·g-1，其中需氧菌、霉菌和酵母菌的主要分布：法半夏在102～104cfu·g-1和10 ～102cfu·g-1，姜半夏和清半夏在103～104cfu·g-1和102～104cfu·g-1，结果见图1和图2。

图1 TAMC 分布图Fig 1 TAMC results

图2 TYMC 分布图Fig 2 TYMC results

32 批半夏中，共有15 批检出耐热菌，计数结果在10 ～550 cfu·g-1，检出率为46.9%。耐热菌鉴定结果主要为芽孢杆菌属，有地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、坚固芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；检出2 批少动鞘氨醇单胞菌。结果表明，半夏经过30 min 煎煮，大部分条件致病菌可得到有效控制，但仍有不少芽孢杆菌能存活下来。

3.2.2 控制菌检查 3 批耐胆盐革兰氏阴性菌定量实验呈阳性，污染范围均在10 ～102cfu·g-1，3 种半夏各占1 批。结果表明，3 种半夏的耐胆盐革兰氏阴性菌负载水平较低。32 批半夏饮片均未检出大肠埃希菌和沙门菌，但有13 批在控制菌检查中发现可疑菌落，主要为以下5 类菌：成团泛菌属、非脱羧勒克氏菌、肺炎克雷伯菌、赫氏埃希菌和阴沟肠杆菌，分别占30.7%、23.1%、15.4%、15.4%、15.4%。

4 讨论

传统的标准冻干菌株在复苏、传代和稀释中步骤烦琐、操作耗时。工作菌液需稀释多个数量级，才能达到实验的要求，不仅对实验者的稀释操作要求较高，对每次传代培养的菌液浓度也有严格要求；而实际操作中，工作菌液的浓度常因传代菌株的活性、接种量、培养时间和保存温度及时间而产生较大的差异，实验者往往会因为培养后菌液组的数量达不到药典要求而不得不重复方法适用性实验，费时费力。《中国药典》2020年版四部9203 药品微生物实验室质量管理指导原则里指出，可使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株作为工作菌株[13]。本法适用性实验中，使用的是商品化定量菌株，只需将定量菌株按操作要求进行复溶即可，且菌量稳定。定量菌株的使用，既缩短了菌液的培养和配制稀释的时间，又保证了菌活性和浓度，省时省力，值得推广。

3 种半夏在炮制过程中，使用不同的辅料进行煎煮、浸泡、洗净及晾干。虽然部分辅料（如姜、明矾等）存在一定的抑菌性，但经过炮制后，浓度被稀释，抑菌效力减弱，故3 种半夏在微生物限度的方法适用性的结果均无抑菌性，可采用常规平皿法进行微生物限度检查。也正因为3 种半夏炮制过程中使用到含抑菌性的辅料，且在炮制煎煮过程中灭活部分的微生物，半夏饮片相较于仅进行简单晾晒切割的中药饮片，如通草[14]、红花[15]，鱼腥草[16]等，本底污染微生物的负载量要少2 ～3 个对数级别。半夏饮片的控制菌污染主要为成团泛菌属、非脱羧勒克氏菌、肺炎克雷伯菌肺炎、赫氏埃希菌和阴沟肠杆菌，虽然不是2020年版《中国药典》要求的控制菌，但均为条件致病菌，在检查中应关注。

半夏的耐热菌污染主要来自于两大类，一类是耐热的革兰氏阳性芽孢杆菌，另一类是革兰氏阴性条件致病菌。芽孢杆菌属主要源于土壤，枯草芽孢杆菌虽为常见的环境菌，但仍会导致部分人群感染[17]；此次在耐热菌检测中检出少动鞘氨醇单胞菌，该菌为革兰氏阴性杆菌，是院内感染的致病菌之一[18]。半夏常以煎煮后的汤剂形式服用，近几年流行养生茶直接泡服，参照2020年版《中国药典》，按直接口服及泡服饮片要求，本次实验霉菌和酵母菌总数中，有7 批次不符合要求；且从15批半夏中检出耐热菌，为了保障群众的用药安全，应对半夏的上述两项微生物指标进行限值规定。

在方法学适用性实验中，对样品先进行115℃、20 min 灭菌处理以减少本底菌数量过大的干扰，摸索出合适的限度方法后，再对未灭菌的样品进行污染性探究实验。在TAMC、TYMC中，相邻10 倍稀释级别的菌落数均呈现10 倍数值左右的比例，再次表明样品不具有抑菌性。若样品相邻稀释级别的菌落数倍数差异不成比例时，应考虑样品的抑菌因子被灭菌处理所破坏，应调整样品前处理的灭菌温度和时间，重新进行实验，减少对抑菌因子的破坏。

本次实验未检出大肠埃希菌和沙门菌，但并不代表此类致病菌不存在于半夏样品中。本次实验样本数量偏少，接下来将进一步扩大样本数量，寻找各地有代表性的样品，同时开展更多炮制后可降低微生物数量的中药饮片的微生物限度方法建立和污染调查，为药典制订该类中药饮片的微生物限值提供数据支持。

2020年版《中国药典》新增了中药材饮片的微生物限度检查方法，目前仅对中药提取物、直接口服及泡服饮片的微生物限度标准提出要求。而欧洲药典7.0 版（EP7.0）、日本药典16 版（JP16）和美国药典36 版（USP36）早已明确需煎煮类的中药材饮片的微生物限度标准，包括TAMC、TYMC 以及控制菌[19-21]。范一灵等[12]的研究表示，炮制过程不涉及热加工和涉及热加工的中药饮片的需氧菌和耐热菌计数有显著性差异，热加工处理的中药饮片，需氧菌和耐热菌计数比不涉及热加工的低。张平等[10]分析50 种药材饮片，非热加工方式切制净制饮片的微生物负载最高，热加工方式的煮制、炒制、蒸制饮片次之，热加工与非热加工的炮制方式对需氧菌、霉菌和酵母菌有明显差异（P＜0.05），对耐热菌无显著差异（P＞0.05）。

笔者认为，应根据中药材饮片的炮制方式和服用方式，将中药饮片进行分类，炮制方式分为炮制或预处理后不能降低微生物数量、炮制后可降低微生物数量、直接干燥或打粉三类，服用方式分为不需煎煮和需煎煮两类，根据不同的炮制方式和服用方式的相互组合，增加TAMC、TYMC、耐热菌的限值指标。控制中药材饮片的微生物指标，降低药材本身的各类污染菌，可以在一定程度上延长饮片的保存期限，保证药材的质量和药效。此外，中药材饮片的微生物数量得到一定的控制后，也可降低下游中成药制剂的微生物负载量，减少因原材料中药材带来的微生物污染，在一定程度上减轻制药企业的产品过程控制和终端灭菌的压力。