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淫羊藿苷对顺铂诱导的小鼠急性肾损伤保护作用及其作用机制研究

2022-08-05赵建通刘文瞻万洪磊路志民郭明涛王冰肖波

特产研究 2022年4期
关键词:肾小管结果表明肾脏

赵建通,刘文瞻,万洪磊,路志民,郭明涛,王冰,肖波

(邯郸市第一医院泌尿外科河北 邯郸056000)

顺铂(Cisplatin,CDDP)是一种广泛应用于肺、睾丸和卵巢癌等实体恶性肿瘤的临床化疗药物,具有强烈的肾毒性,由CDDP诱导的急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)限制了该类药物的应用[1-3]。据统计约有1/4的接受CDDP化疗的患者出现了AKI症状[4]。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是中草药淫羊藿的主要活性成分之一,为8-异戊烯基黄酮苷类化合物。ICA具有抗炎,免疫调节,补肾壮阳、抗衰老等功效[5,6]。在之前的研究中已经报道了ICA对肾脏疾病的治疗作用,但有关ICA对CDDP诱导的急性肾损伤研究仍然较少[7,8]。本研究通过建立顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型,探究淫羊藿苷对急性肾损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

40只9周SPF级C57BL/6雄性小鼠,体重(27±2)g,购自浙江省实验动物中心,许可证编号:SYXK(浙)2021-0040。

1.2 药品与试剂

顺铂注射液(货号:SC5170),溶于0.9%生理盐水,购自北京索莱宝科技公司。淫羊藿苷粉末(货号:S2312),纯度>99.05%,溶于0.9%生理盐水,购自Selleckchem公司;白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)及转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)等酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒,购自上海仁捷生物科技有限公司;磷酸化核因子(p-p65)多抗、I B多抗、-肌动蛋白(-actin)多抗及山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗购自上海碧云天公司。

1.3 仪器

CX23光学显微镜,日本奥林巴斯株式会社;Synergy H4全功能酶标仪,美国Bio Tek公司;ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统,美国Bio-Rad公司。

1.4 动物模型建立及分组[7,9,10]

将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组(Control),淫羊藿苷组(CIA),顺铂模型组(CDDP),淫羊藿苷治疗组(CDDP+CIA),每组10只。老鼠生长与12/12 h的明暗周期环境中,温度(23±1)℃,湿度50%±5%,自由采食,自由饮水,适应性饲养1周。Control组腹腔注射等剂量0.9%生理盐水,CIA组灌胃20 mg/kg淫羊藿苷,连续7 d,CDDP组一次性腹腔注射13 mg/kg CDDP。CDDP+CIA组在腹腔注射CDDP 5 d后连续灌胃20 mg/kg淫羊藿苷7 d。

1.5 血清中BUN、Scr检测

实验结束收集小鼠血液样本。小鼠血清Scr及BUN水平用标准试剂盒检测(南京建成),依据说明书进行操作[11]。

1.6 肾脏指数计算

实验结束后处死小鼠,取小鼠肾脏称重,小鼠肾脏指数计算=小鼠肾脏重量/小鼠体重重量。

1.7 苏木精 伊红染色观察肾脏中组织病理学变化

处死小鼠后,将小鼠肾脏浸入4%多聚甲醛中固定48 h,乙醇梯度脱水,利用二甲苯对组织进行透明处理,浸蜡包埋,切片机将组织切片(3~5m),苏木精伊红染色,二甲苯透明后经树胶封片,在光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.8 ELISA检测肾脏中IL-1、IL-6、IL-10和TNF- 表达情况

颈椎脱臼处死小鼠,分离小鼠肾脏,PBS充分清洗后用滤纸充份吸干,取小鼠肾脏于PBS中匀浆,离心后,用ELISA试剂盒检测肺组织IL-1、TNF-、IL-6和IL-10含量,具体步骤按照试剂盒说明书进行。用酶标仪检测光密度(OD 570 nm)值,根据标准曲线计算浓度。

1.9 蛋白质印迹法检测肾脏中P65和I B 蛋白水平

取液氮保存的小鼠肾脏组织,充分研磨后转至离心管,加入RIPALysis Buffer(RIPA)及蛋白酶抑制剂(PMSF)混合(100:1)的细胞裂解液于冰上裂解。用BCA试剂盒测定蛋白浓度,取样本40g按比例与上样缓冲液混合,其他按文献步骤进行操作[12,13],蛋白表达量以目的条带/-肌动蛋白(-actin)的灰度值表示。

1.10 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析,Duncan多重检验进行分析。每个试验至少重复3次,数据以均值+标准差(SD)表示。

2 结果

2.1 各组小鼠体重及死亡率变化

与Control组比较,淫羊藿苷(CIA)组小鼠体重无显著差异,顺铂(CDDP)处理组小鼠体重显著下降(P<0.01),CDDP+CIA处理组小鼠体重显著下降(P<0.05)(图1 A)。且CDDP处理组分别在第3天、第7天、第9天及第11天出现小鼠死亡;CDDP+CIA处理组在第5天出现小鼠死亡(图1 B)。以上结果表明CDDP处理降低小鼠生长性能,CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠生长性能下降。

图1 小鼠体重及死亡率Fig.1 The body weight and mortality of mice

2.2 各组小鼠肾脏指数变化

与Control组比较,CIA组与CDDP+CIA处理组小鼠肾脏指数无显著差异,CDDP组小鼠肾脏指数显著下降(P<0.05)(图2 B)。且肾脏剖检结果表明,相比Control组与CIA组,CDDP处理组小鼠肾脏被膜表面出现凹凸不平、缺血等现象,而CDDP+CIA处理组小鼠肾脏无显著差异(图2 A)。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠肾脏损伤,CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠肾损伤。

图2 小鼠肾脏指数变化Fig.2 Changes of renal index in mice

2.3 各组小鼠血清中肌酐及尿素氮水平变化

与Control组相比较,CIA组小鼠血清中Scr、BUN水平无显著差异,CDDP组小鼠血清中Scr、BUN水平极显著上升(P<0.01)。与CDDP组比较,CDDP+CIA组小鼠血清中Scr、BUN水平显著下降(P<0.01)。以上结果表明CDDP处理降低小鼠肾功能,保护剂CIA缓解由CDDP诱导的小鼠肾功能损伤,见图3。

图3 小鼠血清中肌酐及尿素氮水平变化Fig.3 Changes of creatinine and urea nitrogen levels in serum of mice

2.4 各组小鼠肾组织病理变化

镜下观察小鼠肾组织病理变化,结果表明:Control组与CIA组小鼠肾小管形态完好,肾小管细胞整齐排列正常;CDDP组可观察到肾小管发生炎性病变,肾小管管腔内存在大量红细胞及炎性细胞浸润。CDDP+CIA组可观察到小鼠肾小管的炎性病变减轻,表现为肾小管形态回归正常,肾小管内红细胞及炎性细胞减少。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠肾脏发生病变,CIA有效缓解由CDDP诱导的小鼠肾脏病变,见图4。

图4 小鼠肾组织病理变化Fig.4 Pathological changes of renal tissue in mice

2.5 各组小鼠肾脏中炎性因子变化

如图5所示,与Control组比较,CDDP组小鼠肾脏中炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表达水平均显著上升(P<0.01),抑炎因子IL-10表达水平显著下降(P<0.01)。与CDDP组比较,CDDP+CIA组小鼠肾脏中炎性因子TNF-、IL-1和L-6表达水平显著下降(P<0.05),抑炎因子IL-10表达水平显著上升(P<0.05)。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠炎症反应,CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠炎症反应,见图5。

图5小鼠肾脏中炎性因子变化Fig.5 Changes of inflammatory factors in mouse kidney

2.6 各组小鼠肾脏中NF-B信号通路蛋白表达变化

如图6所示,与Control组比较,CDDP组小鼠肾脏中核因子蛋白P65的磷酸化水平显著升高,而P65蛋白的阻遏物I B蛋白的表达显著下降(P<0.01);与CDDP组比较,CDDP+CIA组小鼠肾脏中p-P65蛋白表达显著下降,I B蛋白的表达量显上升(P<0.05)。以上结果表明CDDP处理激活小鼠体内NF-B信号通路,CIA能抑制由CDDP激活NF-B信号通路。

图6 小鼠肾脏中NF-B信号通路蛋白表达变化Fig.6 Changes of NF-B signaling pathway protein expression in mouse kidney

3 讨论

顺铂是一种临床上广泛应用的化疗抗肿瘤药物,由CDDP诱导的急性肾损伤限制了该类药物的使用,而由炎性粒细胞积累产生的炎症反应是CDDP产生急性肾损伤的主要诱因之一,因此抑制炎症通路、减轻肾脏炎性反应是治疗该病的关键[14]。淫羊藿苷是中草药淫羊藿的主要活性成分之一,具有抗炎,补肾壮阳作用[7,15]。本研究本研究通过建立CDDP诱导的小鼠急性肾损伤模型,探究ICA对急性肾损伤的保护作用。

结果表明,CDDP诱导小鼠产生严重的急性肾损伤,在CDDP处理组中,小鼠死亡率增加,体重下降,血清中Scr和BUN指标,炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表达水平增加,NF-B信号通路被激活;而CIA处理能显著降低由CDDP诱导的小鼠肾损伤,以上结果提示ICA对CDDP诱导的小鼠急性肾损伤有一定的治疗作用,并且其可能是通过抑制小鼠体内NF-B信号通路以降低小鼠炎症反应来实现的。

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