马川兰，李 会

（河南工业大学 漯河工学院，河南 漯河 462000）

石榴（Punica granatum L）本名安石榴，属于落叶乔木或灌木［1］7。根据籽粒的软硬口感分为软籽、半软籽和硬籽石榴三类。软籽石榴种核特软，受到人们的重视和喜爱。在众多的软籽石榴中，河南省荥阳石榴基地的河阴突尼斯软籽品种果实美观早熟，籽粒色泽鲜艳，尤其果核特软，加上人们对石榴营养价值和保健功能的重视，彻底改变了中国消费者对石榴果品的认知。它含有丰富的膳食纤维和维生素C，还含有花青素、植物性黄酮、多酚类物质、有机酸等生理活性成分。

花青素（anthocyanin）具有抗氧化、抗癌、降血脂、抗衰老、减肥、抑菌、抗疲劳、改善白内障等效果［2-7］。Ana Cristina Miranda Senna Gouvea［8］利用HPLC法测得石榴汁中含有六种花青素，朱峰［9］发现石榴中花青素较高的是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3，5-葡萄糖苷。而河阴突尼斯软籽石榴中花青素的含量情况鲜有报道。本研究利用柠檬酸-乙醇法提取河阴突尼斯软籽石榴中的花青素，通过单因素实验和正交实验进行优化，得到最佳提取工艺，为其作为原料应用于保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

河阴突尼斯软籽石榴：网购。

95%乙醇：洛阳市化学试剂厂。

柠檬酸≥99.5%：天津市科密欧化学试剂有限公司。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品≥98%：成都植标化纯生物技术。

无水乙醇≥99.7%：开封市铁塔试剂厂。

浓盐酸：开封市芳晶化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

HH-8 数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司。

FA2004型电子天平：上海上平仪器有限公司。

202 型电热恒温干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂。

UV-2600紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

HR1876 飞利浦榨汁机：飞利浦电子香港有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将石榴粒放入榨汁机中处理，得到石榴汁；将果渣用纱布进行过滤，得到石榴汁。用3 层纱布再次过滤，得到石榴汁原液，并倒入广口瓶内，放置在冰箱内，冷藏保存。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品10 mg（精确到0.001 g），置于50 mL 容量瓶中，用0.8%盐酸-乙醇溶液定容，配置成浓度为200 μg/mL的标准溶液。

利用移液管分别准确吸取0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL标准溶液于10 mL容量瓶，用盐酸-乙醇混合溶液定容至刻度，浓度分别为4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、12.0 μg/mL、16.0 μg/mL、20.0 μg/mL、24.0 μg/mL。测定波长在520 nm 处的吸光值，准确记录数据，并绘制标准曲线。

1.3.3 单因素实验设计

以10%柠檬酸-80%乙醇为提取剂，考察提取温度、浸提时间、酸醇比、料液比对花青素提取含量的影响。

（1）提取温度的确定

用移液管准确移取5 份2.0 ml 石榴果汁，并称量样品质量。确定浸提时间为2 h，料液比为1∶20，10%柠檬酸/80%乙醇为5∶5，提取温度分别处于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，并进行浸提、冷却、离心、测定吸光度。

（2）浸提时间的确定

用移液管准确移取7 份2.0 ml 的石榴果汁，并称量样品的质量。确定提取温度为40℃，料液比为1∶20，10%柠檬酸/80%乙醇为5∶5，浸提时间分别处于30 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，并进行浸提、冷却、离心、测定吸光度。

（3）酸醇比的确定

用移液管准确移取7 份2.0 ml 的石榴果汁，并称量样品质量。确定提取温度为40℃，浸提时间为2 h，料液比为1∶20，10%柠檬酸/80%乙醇分别处于2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，并进行浸提、冷却、离心、测定吸光度。

（4）料液比的确定

用移液管准确移取5 份2.0 ml 的石榴果汁，并称量样品质量。确定提取温度为40℃，浸提时间为2 h，10%柠檬酸/80%乙醇为5∶5，料液比分别处于1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，并进行浸提、冷却、离心、测定吸光度。

1.3.4 正交试验设计

建立正交试验因素水平表，探究A提取温度、B浸提时间、C酸醇比、D料液比4个提取因素对石榴花青素含量的影响，L9（34）正交试验因素水平表见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 花青素含量计算公式的建立

2.1.1 标准曲线

根据1.3.2方法绘制标准曲线（见图1），得到标准曲线为y=0.0505x+0.0342，R2=0.9982。结果表明，标准品的浓度与吸光度具有良好的线性关系，并且由7 次测定的数据可得到RSD=0.002964（2%），可判断仪器精密度可靠。因此，对于同一原料，利用相同的提取方法、同样的仪器测定吸光度的实验，其重复性较好。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线

2.1.2 花青素含量的计算

花青素含量计算公式如下：

其中，C 为吸光度下对应的质量浓度（μg/mL）；V 为样品浸提液的总体积（mL）；M为所使用的石榴汁对应的质量（g）。

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 提取温度对花青素含量的影响

花青素对温度极其敏感。由图2 可知，随着温度的升高，经过提取得到的花青素含量逐渐升高；40℃时，其花青素含量最高；超过40℃时，花青素含量逐渐降低。

图2 提取温度对花青素含量的影响

2.2.2 浸提时间对花青素含量的影响

浸提时间不同会影响花青素的溶出率。由图3可知，随着浸提时间的加长，花青素含量逐渐增高；花青素含量在浸提时间为2.5 h时达到最高；当浸提时间超过2.5 h时，花青素含量呈现下降趋势。浸提时间为30 min 的花青素含量大于1 h 的花青素含量，可能是时间过短，从而导致花青素未完全溶出。但是，两者之间的花青素含量不具有显著性差异（P>0.05）。

图3 浸提时间对花青素含量的影响

2.2.3 酸醇比对花青素含量的影响

花青素的颜色会随着酸碱度的不同而发生显著的变化。在酸性条件下，一般呈现红色，结构比较稳定；在碱性条件下，花青素的结构不稳定。所选的不同酸醇比的混合溶剂PH 酸碱度都在2-3 范围内。但是，随着酸含量的增加，其提取出的花青素出现了上升的趋势。由图4可知，随着酸醇比的变大，花青素含量逐渐升高；当酸醇比处于7∶3时，花青素含量最高；当酸醇比高于7∶3时，花青素含量变小。

图4 酸醇比对花青素含量的影响

2.2.4 料液比对花青素含量的影响

花青素在溶剂中的溶解度是有限的，溶质与溶剂的比例不同时，会影响花青素的溶出量，间接影响吸光度值。由图5可知，随着料液比的缩小（提取剂体积增加），花青素含量逐渐升高；当料液比处于1∶20时，花青素含量最高；当料液比小于1∶20时，花青素含量逐渐变小。

图5 料液比对花青素含量的影响

2.3 正交试验

正交试验结果和方差分析结果见表2和表3。

由表2知，因素影响的主次因素为酸醇比>提取温度>料液比>浸提时间。由表3知，提取温度、酸醇比和料液比对实验结果有显著性影响，最优水平的选择应该根据K值来判断，即A2C3D1；而浸提时间的改变对实验结果不具有显著性影响，从经济的角度考虑，选B1。因此，试验优组合为A2B1C3D1。此组合不包括在9组试验中，应该进行验证。

表2 L9（34）正交试验结果

表3 方差分析表

2.4 验证试验

用移液管准确移取2 份2.0 ml 的石榴汁，并称量样品质量。按照正交试验后得到的最优提取条件提取软籽石榴中的花青素，并将最优提取条件的花青素含量和正交试验中的最佳进行平行比较，判断最佳提取条件。

由表4 可知，将正交实验中的最佳组合与推算出来的最佳水平的结果进行比较，发现A2B1C3D1的提取条件下得到的花青素含量更高；同时，经方差分析发现，两者实验结果间不具有显著性差异，这可能与提取温度、浸提时间的交互作用有关。另外，从经济角度考虑，提取时间为1.5 h，能够节省电能的消耗，节约成本。综上所述，可判断最优提取条件应该为提取温度为40℃，浸提时间为1.5 h，酸醇比为8∶2，料液比为1∶10。

表4 验证实验结果分析

3 结论

正交试验结果表明，考察因素对花青素提取含量的主次因素为酸醇比>提取温度>料液比>浸提时间。其中，提取温度、酸醇比和料液比对实验结果有极显著性影响（P0.01），浸提时间对实验结果没有显著性影响。

本试验以河阴突尼斯软籽石榴作为实验对象，利用10%柠檬酸-80%乙醇混合溶剂作为提取剂，通过柠檬酸-乙醇法提取石榴汁中花青素，得到最佳提取条件为浸提时间为1.5 h，提取温度为40℃，料液比为1∶10，酸醇比为8∶2，最终得到的花青素含量为133.81±3.68 μg/g。