夏 非， 张海平

(南通大学第二附属医院/江苏省南通市第一人民医院骨科， 江苏 南通 226000)

骨肉瘤是常见的青少年和儿童骨恶性肿瘤，约占青少年恶性肿瘤的50%，恶性程度高，易发生恶性转移，尤其是肺部转移，严重威胁患者的生命[1,2]。目前，骨肉瘤的治疗方式主要是放疗和化疗，在骨肉瘤的化疗中，多柔比星、顺铂、异环磷酰胺等为一线治疗药物，其中顺铂治疗的副作用较大，容易引发耐药性，临床上多应用顺铂联合化疗，以此来降低顺铂的毒性以及耐药性[3]。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性胺氧化酶，LSD1已经被报道可在多种肿瘤中高表达，包括乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌等，可调控肿瘤的生长和转移，并且被认为是干预肿瘤发生发展的潜在靶点[4]，SP2509是一种LSD1拮抗剂，可抑制LSD1的表达[5]，本文将SP2509和顺铂联合给药于骨肉瘤细胞，旨在探究SP2509和顺铂对骨肉瘤生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料:骨肉瘤细胞系MG-63、HuO9、U-2OS、人成骨细胞hFoB1.19(购自中科院上海细胞库)，CCK8试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(购自沈阳万类生物技术有限公司)；cDNA合成试剂盒、qRT-PCR试剂盒(福麦斯生物技术有限公司)；顺铂(购自Sigma公司)；SP2509(购自南京百鑫德诺生物科技有限公司)，LSD1、LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2、GAPDH、山羊抗兔IgG(购自Cell Signaling Technology公司)

1.2细胞培养:取液氮保存的MG-63细胞，解冻后迅速转移至10mL的含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃的恒温恒湿的细胞培养箱中，细胞贴壁后隔天更换培养基，细胞生长至汇合率达80%时进行细胞传代，取对数生长期的细胞进行后续研究。

1.3CCK8法检测细胞增殖抑制率:取对数生长期的MG-63细胞接种于96孔板中，每孔接种8×103个/100μL，培养至细胞贴壁后，取出96孔板内的培养基，每孔加入不同浓度的SP2509(0、10、20、40、60μmoL/L)和顺铂(0、5、15、25、40μmoL/L)100μL含药培养液，并设置不接种细胞仅加入培养基的空白对照孔组，继续培养24h后，每孔加入10μL CCK8溶液，使用酶标仪在450nm下检测各孔的OD值，细胞抑制率=1-(OD实验组-OD空白对照组)/(OD正常对照组-OD空白对照组)×100%。用Graphpad prism8.0计算IC50(半数抑制浓度)值并绘制细胞增殖抑制曲线。

1.4分组与给药:根据SP2509和顺铂的IC50值确定IC50值的一半作为给药浓度，即将MG-63细胞分为对照组、SP2509组(20μmoL/L)、顺铂组(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)联合顺铂组(10μmoL/L)，按照上述分组将细胞接种于6孔板中，每组3个复孔，分别培养24h后进行细胞凋亡和细胞自噬检测。

1.5qRT-PCR检测LSD1 mRNA的表达:根据TRIzol试剂盒提取MG-63、HuO9、U-2OS、hFoB1.19细胞总RNA，核酸定量后，根据cDNA试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后使用qRT-PCR试剂盒进行反应，以GAPDH为内参，反应条件为：50℃激活2min、95℃2min、循环95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，共40次循环。循环结束后设置95℃15s，60℃1min，95℃15s,使用2-△△CT法计算LSD1 mRNA相对表达量。LSD1和GAPDH引物序列见表1。

表1 LSD1和GAPDH引物序列

1.6流式细胞术检测细胞凋亡:取对照组、SP2509组(20μmoL/L)、顺铂组(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)联合顺铂组(10μmoL/L)组细胞各1×105个于流式管中，每组3个复孔，使用无菌PBS清洗2次，根据细胞凋亡检测试剂盒，每管加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染料，避光孵育1h后，用PBS溶液清洗2次后，使用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。

1.7Western blot检测LSD1、LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2表达:分别收集对照组、SP2509组(20μmoL/L)、顺铂组(10μmoL/L)、SP2509(20μmoL/L)联合顺铂组(10μmoL/L)组细胞1×106个于离心管中，并加入200μL的RIPA蛋白裂解液，裂解30min后，12000r离心15min，收集上清即为细胞总蛋白，使用BCA试剂盒进行蛋白定量后，将蛋白样品与50μL的上样缓冲液混匀，沸水浴5min后，取各组蛋白10μg进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过转膜、封闭、清洗后，将PVDF膜与LC3-Ⅱ、P62、Caspase3、Bcl-2、LSD1抗体4℃条件下共孵育过夜，与山羊抗兔IgG抗体共孵育1.5h后曝光并显影，使用Image J软件进行定量分析。

2 结 果

2.1LSD1在骨肉瘤细胞中高表达:qRT-PCR检测结果显示，骨肉瘤细胞系MG-63、HuO9、U-2OS细胞系中LSD1 mRNA表达显著高于人成骨细胞hFoB1.19细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 hFoB1.19MG-63 HuO9 U-2OS细胞中LSD1mRNA相对表达量比较

2.2SP2509和顺铂IG50检测结果:CCK8检测结果显示，SP2509和顺铂对MG-63的抑制率随着给药浓度的增加而增加，且呈剂量依赖性，SP2509对MG-63细胞的IC50值约为40μmoL/L，顺铂对MG-63的IC50值约为20μmoL/L，选择IC50的二分之一作为给药浓度，即SP2509 20μmoL/L和顺铂10μmoL/L，详见表3。

表3 SP2509和顺铂细胞抑制率检测结果

2.3SP2509联合顺铂诱导骨肉瘤细胞的凋亡：流式细胞术检测结果显示，相比于对照组，SP2509组和顺铂组MG-63细胞凋亡水平显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。SP2509联合顺铂组MG-63细胞凋亡水平显著高于SP2509组和顺铂组，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见图1和表4。Western blot检测结果显示，相比于对照组，SP2509组和顺铂组MG-63细胞促凋亡蛋白Caspase 3表达显著高于对照组，抑凋亡蛋白Bcl-2表达显著低于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。而SP2509联合顺铂组细胞中Caspase 3显著高于SP2509组和顺铂组，Bcl-2表达显著低于SP2509组和顺铂组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见图2和表5。

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡水平

表4 各组细胞凋亡水平比较

图2 各组细胞凋亡相关蛋白Caspase 3和Bcl-2表达比较

表5 各组细胞Caspase 3和Bcl-2表达水平比较

2.4SP2509联合顺铂诱导骨肉瘤细胞的自噬:Western blot检测结果显示，SP2509组和顺铂组MG-63细胞中LC3-Ⅱ表达显著高于对照组，P62表达显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。相比于SP2509组和顺铂组，SP2509联合顺铂组细胞自噬均显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见图3和表6，说明SP2509联合顺铂可显著促进骨肉瘤细胞的自噬。

图3 各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62表达比较

表6 各组细胞LC3-Ⅱ和P62表达水平比较

2.5SP2509联合顺铂调控骨肉瘤细胞LSD1表达:Western blot检测结果显示，SP2509组MG-63细胞中LSD1表达显著低于对照组(P<0.05)，顺铂组MG-63细胞中LSD1表达亦显著低于对照组(P<0.05)，并且显著高于SP2509组，说明顺铂对LSD1表达亦有抑制作用，但是其抑制效果低于SP2509，相比于SP2509组和顺铂组，SP2509联合顺铂组细胞中LSD1表达均显著下调(P<0.05)，详见图4和表7，说明SP2509联合顺铂可显著抑制骨肉瘤细胞中LSD1的表达。

图4 Western blot检测各组细胞LSD1表达

表7 各组细胞LSD1表达水平比较

3 讨 论

骨肉瘤是多发病于骨生长活跃的青少年的骨系统原发性恶性肿瘤，起源于间叶组织，其特征为能够产生骨样组织的梭形基质细胞，骨肉瘤的恶性程度高，在发病早期就容易发生肿瘤转移[6]。目前，化疗仍然是骨肉瘤的治疗方案之一，其主要的化疗药物有阿霉素、甲氨蝶呤以及顺铂等，其中顺铂应用广泛，不仅可以通过细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过诱导细胞凋亡发挥治疗作用[7]。虽然近年来新型的化疗方式已经将骨肉瘤患者5年的生存率提高到近70%，但是大剂量的化疗药物引发的毒副作用以及耐药严重威胁着患者的治疗效果，顺铂治疗所导致的肾毒性、胃肠道反应等亦限制了其临床应用[8]，因此探究更多联合用药方案，降低顺铂化疗的毒副作用是骨肉瘤临床研究的热点。

LSD1属于黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性胺氧化酶，它能够特异性催化组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)或H3K9位点的去甲基化，参与染色质结构的重塑进而影响基因的转录调控[9]，研究表明，LSD1可参调控多种肿瘤的发生发展，Sheng W等研究表明LSD1的抑制可刺激黑色素瘤对抗PD-1治疗，并且增强免疫检查点的抑制[10]；Xie Q等研究表明LSD1通过上调LEF1而促进膀胱癌的发展，并且可作为膀胱癌诊断和治疗的潜在靶点[11]。

本研究发现，LSD1在骨肉瘤细胞MG-63、HuO9、U-2OS中表达显著高于其在人成骨细胞hFoB1.19中的表达，研究表明，LSD1在乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌中高表达，并且抑制LSD1可抑制肿瘤的病理进程[12]。顺铂可通过诱导细胞凋亡而治疗肿瘤，LSD1可抑制肿瘤细胞的自噬，SP2509为LSD1的抑制剂，所以本文探究了SP2509联合顺铂对骨肉瘤细胞自噬和凋亡的影响。

细胞凋亡检测结果显示，SP2509联合顺铂组细胞的凋亡数显著高于SP2509组和顺铂组，促凋亡蛋白Caspase 3表达显著增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调，说明SP2509联合顺铂可促进骨肉瘤细胞的凋亡。细胞自噬检测结果显示，SP2509联合顺铂组细胞中LC3-Ⅱ表达显著高于SP2509组和顺铂组，P62表达显著低于SP2509组和顺铂组，研究表明LC3-Ⅱ表达与细胞自噬呈正相关，P62表达与细胞自噬呈负相关[13]，所以可以得出SP2509联合顺铂组可显著促进骨肉瘤细胞的自噬。并且SP2509联合顺铂组细胞LSD1表达显著低于SP2509组和顺铂组，Ye Wei等研究表明，LSD1可负调控卵巢癌细胞的自噬进而调控卵巢癌进程[14]，Angel Chao等研究表明，抑制LSD1可促进P62的稳定性，进而影响妇科恶性肿瘤的自噬[15]，本研究推测SP2509联合顺铂可通过抑制LSD1表达而促进骨肉瘤细胞的凋亡和自噬。但是本文的研究尚存在一定的局限性，仅在细胞水平验证了SP2509联合顺铂对骨肉瘤细胞的影响，其在动物以及在临床评价中的效果尚未得到验证，所以SP2509联合顺铂的应用还需进一步探究。

综上所述，SP2509联合顺铂可抑制骨肉瘤细胞MG-63中LSD1的表达，进而诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬，本研究为骨肉瘤治疗方式的选择提供新的理论依据。但其更多潜在的抗肿瘤机制有待进一步深入研究。