郝蠫 胡二向 李丹丹

（中国检验检疫科学研究院综合检测中心 北京 100123）

1 前言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，属于人体肠道的正常菌群，具有维持肠道微生物平衡、降低胆固醇、抗变异原、抗肿瘤、增强免疫力等重要功能[9]。乳酸菌中的多数种为耐氧性厌氧菌（Aerotolerant anaerobes）和兼性厌氧菌（Facultative anaerobes），少数为严格厌氧菌（Strict anaerobes）。在耐氧性厌氧菌和兼性厌氧菌的能量代谢系统中，由于缺乏电子传递链和氧化磷酸化产能酶系，故只能借糖类的不完全氧化即发酵来获得能量。

乳酸菌作为食用型的微生物，可以调节食品风味，提高食物的生物价，加快人体的消化和吸收[1]。部分结构复杂、分子量较大的蛋白质，在乳酸菌酶的特定作用下，一部分可以降解为游离氨基酸和小分子肽，其中的蛋白质还可以进一步增加氨基酸含量。乳酸菌能够降解少量的脂肪，在其代谢过程中消耗部分维生素，合成叶酸等维生素B族[10]。

因抗生素的使用不当，乳酸菌出现了耐药性，Danielsen等[6]研究发现，乳杆菌在大多数时候，对诺氟沙星、头孢西丁、替考拉丁、庆大霉素、链霉素和卡那霉素等抗生素有耐药性；Muhammad Nawaz等[7]通过耐药性实验对发酵食品中的乳酸菌进行研究，在分离中发现了耐红霉素的基因ermB和耐四环素的基因tetS和tetM。本文以内蒙古锡盟地区传统发酵奶油制品中分离出的10株乳酸菌为试验菌株，测定其对常见抗生素的耐受能力，以期为相关研究提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种来源

分离自内蒙古锡盟不同地区传统发酵奶油制品中的10株乳酸菌，镶黄旗酸油3株（XHS1、XHS2、XHS3）；黄旗黄油2株（XHH1、XHH）；镶蓝旗奶油3株（ZX1、ZX2、ZX3）；阿巴嘎旗的酸油2株（BG1、BG2）。

2.1.2 试剂来源

脱脂乳粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、琼脂粉（生化试剂）；吐温-80、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠（化学纯）；四环素、乙酰螺旋素、青霉素（杭州微生物试剂有限公司）。

2.1.3 培养基制备和培养环境

2.1.3.1 脱脂乳培养基的制备

称取脱脂乳粉10.00 g，加入蒸馏水量100 mL；搅拌加热溶解后调节pH至6.8；110℃灭菌15 min，迅速冷却[8]。

2.1.3.2 MRS培养基

培养基配制：蛋白胨10 g；酵母膏5 g；牛肉膏10 g；葡萄糖20 g；柠檬酸氢二铵2 g；乙酸钠（3H2O）5 g；Tween 80 1 g。缓冲液5 mL，pH 6.2～6.4，121℃灭菌20 min，固体培养基需加入琼脂1.5 g。

2.1.4 仪器与设备

电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；全自动高压蒸汽灭菌锅（OLYMPOS公司）；超净台（苏州安泰空气技术公司）；生化培养箱（303-OA型，天津市通利信达仪器公司）；酸度计（上海佑科仪器有限公司）；恒温水浴锅（S11-Ni2，北京长安科学仪器公司）；生化培养箱（303-OA型，天津市通利信达仪器厂）。

2.2 试验方法

2.2.1 菌种活化

将供试菌株转接至脱脂乳培养基中，37℃厌氧培养24 h；活化2次，转接至脱脂乳中进行第3次活化；将5%接种量转接至液体培养基中，37℃培养24 h，使菌株的活力得到恢复，将菌悬液调制为108CFU/mL。

2.2.2 耐药性的测定

用纸片琼脂扩散法测定乳酸菌对抗生素的耐受能力。将供试菌株涂于琼脂培养基上，将浸染后的抗生素药敏纸片贴于平板上，37℃培养48 h，观测抑菌圈直径（mm）大小。

3 结果与分析

3.1 菌株对四环素的耐受性能力分析

由图1和图2看出，BG1菌的抑菌圈最大，直径为18.9 mm，表明其对四环素的耐受性最弱；ZX3的抑菌圈最小，直径为11 mm，表明其对四环素的耐受性最强；XHS1菌、XHH2菌和ZX2菌对四环素的耐受程度相近，抑菌圈直径分别为16.29 mm、16.23 mm和16.49 mm；XHS3菌的抑菌圈直径为18.13 mm，表明其耐受性强于BG1菌；XHS2、XHH1和ZX1菌的抑菌圈直径分别为14.21 mm、15 mm和14.9 mm，表明其耐受性相对较强；BG2菌的抑菌圈直径比BG1菌小，表明其对四环素的耐受性比BG1菌强。

图1 乳酸菌对四环素的耐受能力

图2 乳酸菌对四环素的抑菌圈图

3.2 乳酸菌对乙酰螺旋素的耐受能力分析

由图3和图4可以看出，ZX2、ZX3菌的抑菌圈直径分别为17.54 mm、18.21 mm，表明其对乙酰螺旋霉素的耐受性最弱；BG1菌的抑菌圈最小直径为7.03mm，表明其对乙酰螺旋霉素的耐受性最强；XHS1，XHH1和XHH2菌的抑菌圈直径分别为13.43 mm、13.43 mm和13.21 mm，表明这3种菌株对乙酰螺旋霉素的耐受性无较大差异；XHS3、ZX1和BG2的抑菌圈直径均大于菌株BG1，表明其对乙酰螺旋霉素 的耐受性也弱于菌株BG1。

图3 乳酸菌对乙酰螺旋霉素的耐受能力

图4 乳酸菌对乙酰螺旋霉素的抑菌圈图

3.3 乳酸菌对青霉素的耐受性的测定结果

由图5和图6可以看出，XHS的2抑菌圈直径最小为12.49mm，表明其对青霉素的抑制力最强；XHH2的抑菌圈直径最大为19.96mm，表明其对青霉素的耐受性最弱；XHS1、XHS3的抑菌圈直径分别为13.80mm、13.28mm，表明其对青霉素的抑制性无较大差异；ZX2、ZX3、BG1的抑菌圈分别为16.85mm、17.23mm和17.21mm，表明其对青霉素的抑制性无较大差异。

图5 乳酸菌对青霉素耐受能力

图6 乳酸菌对青霉素抑菌圈图

3.4 乳酸菌耐药性结果分析

由表4可知，分离的镶黄旗黄油乳酸菌对四环素耐受实验中，XHH2抑菌圈最大，抑菌圈为16.10 mm，说明XHH2对四环素的耐受性最弱；分离的镶黄旗黄油乳酸菌对乙酰螺旋素耐受实验中XHH2在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈为15.11 mm，说明XHH2对乙酰螺旋素耐药性最弱；分离的镶黄旗黄油乳酸菌对青霉素耐受实验中，XHH2在青霉素中抑菌最大，抑菌圈为19.87 mm，可知XHH2对青霉素耐药性最弱。

分离的正镶蓝旗稀奶油乳酸菌对四环素耐受实验中，ZX2抑菌圈最大，抑菌圈为18.92 mm，说明ZX2对四环素的耐受性最弱；分离的正镶蓝旗稀奶油乳酸菌对乙酰螺旋素耐受实验中ZX3在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈为18.12 mm，说明ZX3对乙酰螺旋素的耐药性最弱；分离的正镶蓝旗稀奶油乳酸菌对青霉素耐受实验中ZX3在青霉素中抑菌最大，抑菌圈为17.01 mm，可知ZX3对青霉素的耐药性最弱。

表1 乳酸菌对抗生素的抑菌圈直径

分离的阿巴嘎旗乳酸菌对四环素耐受实验中，BG1抑菌圈最大，抑菌圈为18.92 mm，说明BG1对四环素的耐受性最弱；分离的阿巴嘎旗乳酸菌对乙酰螺旋素耐受实验中BG2在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈为10.98 mm，说明BG2对乙酰螺旋素耐药性最弱；分离的阿巴嘎旗乳酸菌对青霉素耐受实验中，BG1在青霉素中抑菌最大，抑菌圈为16.97 mm，可知BG1对青霉素的耐受性最弱。

4 结论

本文采用内蒙古锡盟不同地区传统发酵奶油制品中的10株乳酸菌，结果表明，在四环素耐受试验中，ZX3对四环素的耐受性最强，抑菌圈为11.01 mm；BG1对四环素的耐性最弱，抑菌圈最大为18.92 mm；ZX2、ZX3对乙酰螺旋霉素的耐受能力最弱，抑菌圈直径分别为17.56 mm、18.12 mm；BG1对乙酰螺旋霉素的耐受性最强，抑菌圈直径最小为7.23 mm。在青霉素耐受试验中，XHH2对青霉素的耐受性最弱，抑菌圈直径最大为19.87 mm；XHS2对青霉素的抑制力最强，抑菌圈直径最小为12.38 mm。